侧柏叶煮散饮片煎煮质量评价＊

宫 璐，白俊其，苏 贺，张 鹏，肖水明，李西文，黄志海＊＊，徐 江＊＊

（1. 广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院/中国中医科学院广东分院 广州 510006；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

侧柏叶煮散饮片煎煮质量评价＊

宫 璐1，白俊其1，苏 贺1，张 鹏2，肖水明2，李西文2，黄志海1＊＊，徐 江2＊＊

（1. 广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院/中国中医科学院广东分院 广州 510006；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

目的：对比侧柏叶煮散饮片与市售原饮片煎煮质量。方法：应用ITS2序列作为DNA条形码对侧柏叶进行分子鉴定，采用化学指纹图谱表征药材化学组成，评价市售饮片及精准煮散饮片的相似度，测定指标成分槲皮苷的含量，标定指纹图谱共有峰。同时，采用标准汤剂煎煮法，比较市售饮片及精准煮散饮片的煎煮效率，对煮散体系进行综合评价。结果：ITS2序列对侧柏叶药材可实现准确鉴定。与原饮片比较，煮散饮片煎煮效率有所增加，且指纹图谱相似度有所提高，但按标准汤剂煎煮法，煮散饮片出膏率增加20%左右，指标性成分槲皮苷的含量未有显著增长，其余化学成分的煎出率也没有明显变化。结论：精准煮散饮片在一定程度上有利于提高侧柏叶的煎煮效率及药材均一性。

中药精准煮散饮片 DNA条形码 侧柏叶 均一性 指纹图谱

中药“煮散”一词始载于唐·孙思邈《备急千金药方》，其使用历史可追溯至先秦时期[1，2]。古人将药材用重器捣碎、刀具切锉成小碎片或粗颗粒后再进行煎煮，使煎煮时“药力尽出”。煮散于唐末至五代十国得以快速发展；至宋代，已盛行，得到了广泛的推广与应用；后因粗末导致的“辨药之难”以及生产发展、药材供应增多，逐渐被饮片所代替。经过数百年的发展，逐步形成了现在通行的常规饮片形制和加工体系。

中药材是中国传统的特产资源，随着人们对身体健康及保健有越来越高的需求，中药材的需求量不断上升。然而，如今中药资源却在逐渐减少，有的品种资源严重匮乏，在巨大的利益驱动下中药材的掺假、混杂现象逐渐增多，中药材质量得不到保障。加之历史和地区习俗等多种原因，历代草本和各地方标准对很多中药材的基源植物记载均不相同，存在严重的“一名多药”、“同名异物”现象，造成如今中药材市场混乱的现象。

中药材质量的保证是临床用药安全、有效、稳定的前提，而中药材质量控制是一项复杂而艰巨的工程。随着DNA分子鉴定技术及指纹图谱技术的普遍应用，“辨药之难”已不再成为阻碍[3]。根据当前中药材市场的情况，我们提出了“精准煮散饮片”的理论体系，基于传统煮散用药方式，生产批内质量均一的中药粗颗粒或粗末饮片，形成质量信息准确识别溯源，使中医临床疗效评价“有迹可循，有证可依”，结果更为可靠[4]，同时可达到节约资源的目的。

本研究以常用中药侧柏叶为例，对精准煮散饮片用药形式进行探索研究。对比传统切片与煮散饮片的含量均一性、煎煮效率，同时以DNA分子鉴定技术为鉴别手段，研究侧柏叶质量控制方法，以期揭示中药材煮散饮片应用的合理性和优势。

1 实验材料

1.1 主要仪器

2469型高效液相色谱仪系统（美国Waters公司）；Empower 色谱工作站；BT125D型电子分析天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）；HTP-312电子天平；DK-S26型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；5430R型离心机（德国Eppendorf公司）；中药材粉碎机；R1002B型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；ProFlex型 PCR仪（美国Life Technologies公司）；Mini-Sub Cell GT型水平电泳槽（美国Bio-Rad公司）；GelDoc XR+型凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）；1-14 小型离心机（德国Sigma公司）；MX-RL-E型混合仪（大龙兴创仪器有限公司）。

1.2 试药

槲皮苷（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，生产批号：20140315）； DP305植物组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；Glodview（上海赛百盛基因技术有限公司）；Tris-HCl（上海麦克林生化科技有限公司，生产批号：T818979）；Tris（美国Sigma公司，生产批号：V900483）；β-巯基乙醇（美国Sigma公司，生产批号：M6250）；琼脂（美国Sigma公司，生产批号：V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，2×Taq PCR Mix酶（北京艾德莱生物科技有限公司）；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余均为分析纯。

侧柏叶（康美药业股份有限公司，产地：广东，批号：0300421、160512161、160803911），经广东省中医院黄志海主任中药师鉴定均为2015年版《中国药典》（一部）侧柏叶项下收载品种。

2 实验方法

2.1 DNA 分子条形码鉴定

选取饮片样本约40 mg，用组织研磨仪磨碎，采用植物DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取基因组总DNA。ITS2序列扩增采用正向引物ITS2F： 5‘-ATGCGATACTTGGTG TGAAT-3’，反向引物：ITS3R： 5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，进行扩增。PCR扩增程序与文献一致[6]。产物采用1.2 %琼脂糖凝胶电泳进行检测，将电泳条带清晰、明亮、单一的PCR产物送测序公司进行双向测序。所得序列采用Codon Code Alinger 6.02软件进行校对拼接，去除低质量区并采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S 和28S区段，获得完整的ITS2序列。利用软件MEGA 6.06分析比对，分析ITS2序列特点[5]。

2.2 原饮片与煮散饮片出膏率比较

取侧柏叶原饮片（批号：160300421），粉碎，过筛，取5-10目（2-4 mm）、10-24目（0.8-2 mm）、24-65目（0.25-0.8 mm）等不同粒径范围的煮散饮片。

称取原饮片及不同规格煮散饮片各100 g，采用标准汤剂的方法[7]进行煎煮。所得提取液减压旋蒸至100 mL，即浓缩为相当于侧柏叶饮片1 g·mL-1的溶液。蒸发皿烘干至恒重，精密量取25 mL溶液，蒸干，105℃保持3 h，称重，计算得干浸膏重量和药材出膏率。

2.3 HPLC检测方法

2.3.1 色谱条件的建立

色谱柱：ODS-3 C18（4.6×250 mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相：0.1%的甲酸（A）与乙腈（B），梯度洗脱：0-10 min，95% A；10-20 min，95%-90% A；20-35 min，90%-86% A；35-40 min，86%-85% A；40-50 min，85-80% A；50-60 min，80%-79% A；60-80 min，79-75% A；检测波长：256、286 nm；进样量：10 μL。

2.3.2 溶液的制备

精密称取槲皮苷对照品适量，加超纯水浓度为10、20、30、40、60 μg·mL-1槲皮素系列标准液，置于冰箱中4℃保存，备用。精密量取适量饮片提取液，用水稀释成相当于侧柏叶饮片0.02 g·mL-1的供试品溶液。

2.3.3 考察线性关系

按照“2.3.1”项下色谱条件进样分析。以对照品峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，计算回归方程，考察槲皮苷在上述色谱条件下的线性关系。

2.4 原饮片与煮散饮片均一性比较

图1 侧柏叶市售原饮片及精准煮散饮片形态

表1 传统市售饮片与精准煮散饮片出膏率（±s，n=3）

表1 传统市售饮片与精准煮散饮片出膏率（±s，n=3）

注：与原饮片比较，*P＜ 0.05；“+”：澄清或有糊化现象；“-”：无糊化现象。

饮片规格出膏率/%澄清度糊化度市售原饮片16.49±0.33 + -5-10目（2-4 mm）17.79±0.05 + -10-24目（0.8-2 mm）21.03±0.12* + -24-65目（0.25-0.8 mm）21.60±0.16* + +

饮片共分为3组：A组为原饮片组，分别取3个批次侧柏叶饮片（S1：0300421，S2： 160512161，S3：160803911）各50 g；B组为混合原饮片组（S4-S6），取等份量的上述3个批次侧柏叶饮片，充分混合，均匀摊平，画格分为9份，随机选取3份，从每份中分别称取50 g；C组为煮散饮片组（S7-S9），取等份量的上述3个批次侧柏叶饮片，混合，粉碎后过筛，取10-65目粒径范围煮散饮片，均匀摊平，画格分为9份，随机选取3份，从每份中分别称取50 g。上述9份样品分别按标准汤剂煎煮法进行提取。合并提取液，定容至500 mL，即为相当于饮片0.1 g·mL-1的药液。精密量取药液并用水稀释5倍，采用0.22 μm滤膜过滤，取10 μL进样。

2.5 数据处理

采用SPSS13.0软件进行数据分析，两两比较时，采用独立样本t检验。选取显著性水准α = 0.05，组间差异判断以P＜ 0.05为具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 ITS2序列分析

应用MEGA6.06分析侧柏叶3条ITS2序列特征，发现无种内变异位点。侧柏叶序列长度为220 bp，A、C、 G、T的碱基含量分别为15.91%、30.00%、35.00%、19.09%，GC含量达65.00%。以条形码、二维码的方式展示主导单倍型序列特征[8]，由图2可见，左侧为DNA序列转换而成的彩色条形码图片，右侧二维码图片为QRcode的编码方式进行编码，扫描可读取序列信息。在NCBI数据库中进行BLAST搜索（https：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）结果显示各样品相似性最高的为侧柏Platycladus orientalis，与其最相似序列的相似度为100%。

3.2 不同规格饮片出膏率考察

对出膏率考察结果表明，与原饮片比较，粉碎后不同粒径煮散饮片的出膏率均有增加；不同粒径的出膏率略有差异，其中10-24目、24-65目出膏率较高，实验结果见表1。

3.3 色谱条件考察

将对照品溶液及供试品溶液按“2.3.1”项下色谱条件进行进样，发现该色谱条件下槲皮苷分离度良好，对照品及提取液色谱图见图3。以对照品峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，回归方程为：Y=27257X-11125 (R2= 0.999)，表明槲皮苷在10-60 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

3.4 饮片均一性评价

以槲皮苷为考察指标，测定其在原饮片混合前后及煮散饮片的含量（表2）。由表2可知，3个批次间饮片的槲皮素含量差异较大，混合后原饮片及煮散饮片后均一度有所提高，而指标成分煎出率升高不明显。

3.5 指纹图谱相似度评价

按照“2.3.1”项下含量测定方法，对侧柏叶饮片水提液进行指纹图谱的测定，经检测，286 nm处水提液检出成分最多，因此采用286 nm处色谱图进行指纹图谱的比较分析（图4）。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版），生成指纹图谱共有模式，计算样品的相似度。结果显示，不同市售饮片的指纹图谱相似度有一定差异，混合后指纹图谱相似度提高（表3、表4、表5）。

图2 侧柏叶ITS2主导单倍型序列

3.6 指纹图谱共有峰的标定

本次研究中槲皮苷含量最高，且是2015版《中国药典》（一部）侧柏叶项下含量测定所规定的指标性成分，因此确定以槲皮苷为参照峰（峰20）。其余各峰的峰面积与槲皮苷峰面积比值定义为相对峰面积。经相似度软件匹配后发现286 nm处共有峰有23个（表6）。

4 讨论

现代研究表明，侧柏叶的主要成分是挥发油，黄酮、鞣质等[9]，2015版《中国药典》（一部）以黄酮类成分槲皮苷为含量测定的指标成分[10]，经检测该成分是侧柏叶水提液中含量最高的成分。因此，本研究以槲皮苷为含量均一性测定的指标成分。

本研究采用3D色谱对侧柏叶指纹图谱条件进行摸索，发现侧柏叶成分复杂，但大部分成分含量较低。对比后发现，药材水提液286 nm处检出成分最多，因此采用286 nm处色谱图进行指纹图谱的比较，比对后可发现23个共有峰。该方法可最大限度的检出侧柏叶水提液成分，为该药质量控制提供有效的方法。由于中药成分复杂，有效成分种类繁多，采用一个吸收波长项下的指纹图谱可能并不全面，可采用多个吸收波长指纹图谱进行对比研究，建立更为严格全面的质量控制方法。

图3 槲皮苷对照品（A）、侧柏叶水提液（B）256 nm处色谱图

本研究采用中药侧柏叶对精准饮片用药形式进行探索，结果显示，所取市售3个批次样本的批间差异较大；经混合处理后，批间差异明显减小；经粉碎处理成煮散饮片后，批间差异与直接混合后相似。对比煮散饮片及市售饮片发现，煮散饮片的出膏率有所增加，指纹图谱相似度有所提高，说明精准煮散饮片在一定程度上有利于提高侧柏叶的煎煮效率及药材均一性。按标准汤剂煎煮法，指标性成分槲皮苷的含量未有显著增多，其余化学成分的煎出率也没有太大变化。这可能与侧柏叶原饮片本身粒度较小有关，说明原饮片与煮散饮片煎煮效率基本一致。

表2 原饮片与精准煮散饮片提取液中槲皮苷含量（n= 3）

图4 市售传统饮片及混合后精准煮散饮片HPLC指纹图谱

表3 市售传统饮片指纹图谱相似度

表4 混合后的传统饮片指纹图谱相似度

表5 混合后的精准煮散饮片指纹图谱相似度

表6 286 nm处共有峰相对峰面积比较

1 孙思邈. 备急千金要方. 北京：中国医药科技出版社, 2011：128-156.

2 徐海波. 中药煮散源流考. 河北中医药学报,1999,4：11-13.

3 陈士林,宋经元. 本草基因组学. 中国中药杂志,2016, 40(21)：3881-3889.

4 陈士林,黄志海,丘小惠,等. 中药精准煮散饮片. 世界科学技术-中医药现代化,2016,9：1430-1440.

5 黄娟,李西文,徐文,等. 耳草属岭南药材DNA分子鉴定研究. 世界科学技术-中医药现代化,2016,18(8)：1401-1407.

6 陈士林,姚辉,韩建萍,等. 中药材DNA条形码分子鉴定指导原则.中国中药杂志,2013, 40(2)：141-148.

7 陈士林,刘安,李琦,等. 中药饮片标准汤剂研究策略. 中国中药杂志,2016,40(8)：1367-1375.

8 辛天怡,李西文,姚辉,等. 中药材二维DNA条形码流通监管体系研究. 中国科学：生命科学,2015, 45(7)：695-702.

9 张卫明,单承莺,马世宏. 侧柏叶化学成分及生理活性研究进展.中华中医药学会、山东省千佛山医院.2014年中华中医药学会药膳分会年会论文集. 中华中医药学会、山东省千佛山医院,2014：7.

10 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部). 北京：中国医药科技出版社, 2015：216.

Quality Evaluation of the Decoctions of Platycladus cacumen Between the Precise Powder Decoction Pieces and Traditional Chinese Medical (TCM) Slices

Gong Lu1, Bai Junqi1, Su He1, Zhang Peng2, Xiao Shuiming2, Li Xiwen2, Huang Zhihai1, Xu Jiang2
(1. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine / Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences / China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch, Guangzhou 510006, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed at comparing the precise powder decoction pieces and market raw TCM slices ofP. cacumenover the decocting quality. ITS2 sequence was adopted as a DNA barcode to identifyP. cacumen. The chemical composition of the medicinal materials was characterized by HPLC fingerprints for the evaluation of the similarity of precise powder decoction pieces and market TCM slices. The concentrations of quercitrin were determined using UPLC， and the characteristic common peaks were identified. In addition， the extraction efficiency between the market TCM slices and the precise powder decoction pieces was also compared by standard decoction method. It was found thatP. cacumenwas accurately identified by ITS2 sequences. HPLC fingerprints showed that the extraction efficiency and similarity of the precise powder decoction pieces increased compared with the market TCM slices. However， the extraction yield rate of the precise powder decoction pieces was improved by 20% increased in accordance with the standard decoction method， while the contents of the index component， quercitrin， presented rare increase and the decocting rates of the other chemical components little change in the study. In conclusion， it was indicated that precise powder decoction pieces improved the extraction efficiency and uniformity in comparison with TCM slices.

Precise powder decoction pieces， DNA barcode，Platycladus cacumen， uniformity， chromatography fingerprints

10.11842/wst.2017.01.016

R283

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-12-22

修回日期：2017-01-05

＊ 广东省中医院专项（2015KT1817）：岭南中草药DNA条形码分子鉴定和生态适宜性研究，负责人：黄志海；中国中医科学院中医药健康服务专项（ZZ0908067）：200种岭南中草药DNA条形码研究，负责人：黄志海。

＊＊ 通讯作者：黄志海，硕士，主任中药师，主要研究方向：中药资源与中药鉴定研究；徐江，博士，助理研究员，主要研究方向：中药分子生物学研究。