基于生物靶标网络的中药“一药多效”评价与精准用药＊

牛 明，章从恩，伍珊娜，任永申，师 卓，王伽伯＊，肖小河＊

（1.解放军第三〇二医院全军中药研究所 北京 100039；2.成都中医药大学药学院 成都 611137；3.江西中医药大学药学院 南昌 330004；4.中南民族大学药学院 武汉 430074）

基于生物靶标网络的中药“一药多效”评价与精准用药＊

牛 明1＊＊，章从恩1，2＊＊，伍珊娜1，3，任永申4，师 卓1，王伽伯1＊＊＊，肖小河1＊＊＊

（1.解放军第三〇二医院全军中药研究所 北京 100039；2.成都中医药大学药学院 成都 611137；3.江西中医药大学药学院 南昌 330004；4.中南民族大学药学院 武汉 430074）

“一药多效”是指一味中药往往具有多个不同的药效。“一药多效”是中药的重要特征，也是中医药临床合理用药的基础。但是迄今为止，对中药“一药多效”的现代科学研究鲜有报道。本文以大黄为代表，采用便秘和黄疸动物模型，结合代谢组学和网路药理学分析方法，阐释大黄两种药效可能的作用机制，探索构建基于生物靶标网络的大黄多效性评价方法，为指导中药的精准质控与精准用药提供新的科学依据和技术支持。

中药 一药多效 网络药理学 代谢组学 精准用药

通常一味中药往往具有多个药效，即“一药多效”，如：半夏既可降逆止呕，亦可安神；麻黄主要用于发汗散寒，也能用于利水消肿；大黄兼具泻热攻下、清利湿热、活血逐瘀等功效。“一药多效”是中药的重要特征，也是中医药临床合理用药的基础。但是，对于众多的中药来说，“一药多效”的客观真实性即各种功效的临床医学价值如何？同一中药发挥不同功效的物质基础和作用机制是什么？精准医学下如何发挥中药“一药多效”的特点和优势，指导中药的精准质控与精准用药[1，2]？正视和研究上述问题，是现代临床中药学研究的重要课题，也是推动中药现代化走向临床的重要途径[3，4]。

诚然，临床疗效是评价中药“一药多效”客观真实性的“金标准”，但是临床上常用的是复方治疗，单味应用不多，医学伦理学难以通过，并且临床试验耗费颇大，因而难以实施。药效药理学试验无疑是研究中药“一药多效”最佳方法之一，但常规药理学试验耗费也较大，也难以深入阐析“一药多效”的客观真实性、物质基础和作用机制。近年来，网络药理学和组学等系统生物学方法的快速发展及其在中医药研究中的拓展应用，为研究中药“一药多效”提高快捷高效的新手段。网络药理学技术能够将药物作用网络与生物网络整合在一起，通过网络特征分析，快速、高效预测并筛选中药的有效成分[5]，分析成分之间可能的相互作用[6-8]，并探讨药物可能通过调节哪些生物网络发挥药效的作用机制[9，10]，极大地简化药效物质及其作用机制的发现过程。代谢组学能够系统地分析中药治疗所引起的内源性代谢物的变化，反映机体对内因和外因变化的应答规律，进而探究其作用机制[11-13]和“量-效”关系[14，15]，为临床合理用药提供科学的指导建议。代谢组学和网络药理学两种分析方法虽然在中药研究领域发挥了巨大作用，但其技术本身不可避免存在一定不足，如网络药理学侧重于分析药物的作用，而代谢组学则侧重于机体的变化。因此，如将两者有效结合，将更有利于阐明中药的药效物质及作用机制[16，17]。

大黄是临床常用中药，为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim exBalf.或药用大黄R. officinaleBaill.的根及根茎，以其功效众多、疗效确切著称。主要用于泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、活血祛瘀、清泄湿热等，现代临床应用大黄主要治疗便秘、黄疸、慢性肝炎、慢性肾衰竭、胰腺炎等疾病。大黄的现代研究较为充分，化学成分基本清楚、药效靶标、药物代谢较为明确[18]。

本文以临床常用多功效中药大黄为代表，针对其常用的适应症便秘和黄疸建立动物模型，结合代谢组学和网路药理学分析方法，研究大黄治疗便秘和黄疸可能的药效作用机制及差异，构建基于生物靶标网络的大黄多效性评价方法，以期为提高临床合理用药水平、促进中药现代化加快走近临床提供新的科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

台式低速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司，型号：L-550），电子天平（美国Mettler Toldeo公司，型号：XS-205），超声波清洗器（昆山市仪器有限公司，型号：KQ-500B），超纯水制备系统（美国Millipore公司，型号：Gradient A10 Mill-Q），液相质谱联用仪（美国Agilent公司，型号：Infinite 1290 UHPLC-6550 ifunnelQtof）。大黄为四川若尔盖县的大黄药材（批号：20140423），且经解放军第302医院全军中药研究所肖小河研究员鉴定为蓼科植物唐古特大黄R. tanguticumMaxim. ex Balf。

1.2 动物与试剂

SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠36只[动物许可证号：SCXK-（军）2012-0004]，由军事医学科学院实验动物中心提供。SD大鼠体质量220-240 g。色谱级甲醇（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：151116），色谱级乙腈（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：112189），ACS级Dimethyl sulfoxide（DMSO，美国AMRESCO公司），α-萘异硫氰酸酯（美国Sigma公司，批号：STBD6070V），洛哌丁胺（美国Sigma公司，批号：SLBG7320V）。

1.3 药效学实验

分别以α-萘异硫氰酸酯和洛哌丁胺构建黄疸和便秘的SD大鼠模型，针对不同的模型分别设置正常对照组、模型组和大黄给药组，每组6只大鼠，大黄治疗黄疸的给药剂量为6.60 g·kg-1，治疗便秘的给药剂量为2.10 g·kg-1，均由临床最佳治疗剂量折算。治疗黄疸的药效评价指标为血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP和TBA并结合病理分析结果，具体结果见课题组已发表文献[19]；治疗便秘的药效评价指标为粪便状态和肠推进比率。

1.4 代谢组学实验

血清样本与甲醇1：3的比例混和后，在4℃条件下以12 500 rmp转速离心15 min取上清，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样。色谱柱采用ZORBAX RRHD 300SB-C18column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱温设为30℃，流动相A为乙腈，流动相B为水，流速设定为0.30 mL·min-1。洗脱梯度为0-1 min，5% A；1-9 min，5%-40% A；9-19 min，40%-90% A；19-21 min，90%-100% A；21-25 min，100% A。质谱离子源采用电喷雾电离（ESI），正、负离子检测模式，数据采集范围为80-1 100m/z。

1.5 代谢组学数据分析

代谢组学数据经Profinder软件进行预处理，并采用MetaboAnalyst 3.0＊http：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/[20]对上述数据进行过滤及归一化。归一化后的数据导入SIMCA软件中进行多变量数据分析，包括主要成分分析（PCA）和偏最小二乘法-差异分析（OPLS-DA）。选择OPLS-DA模型中VIP值＞1、|P（corr）|≥0.5且组间具有显著性差异（P＜0.05，Fold change＞1.5）的化合物[21]，并通过METLIN数据库＊＊http：//www.metlin.scipps.edu/进行化合物鉴定，将有鉴定结果的化合物作为生物标志物。

1.6 大黄药物靶标收集及生物靶标网络构建

基于TCM database@Taiwan、TCMSP等中药数据库，获取大黄相关的化学成分及其分子结构。采用在线靶标预测软件Pharmmapper＊http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php预测各成分可能的作用靶标，保留Score＞4.0的靶标；从KEGG数据库中获取与大黄疗效生物标志物相关的蛋白作为疗效靶标，以DIP蛋白质相互作用数据库＊＊http：//dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Software1.cgi为纽带，将上述药物作用靶标与疗效靶标进行关联，构建生物靶标网络。为方便关联，网络中涉及的所有蛋白编号统一转化为Uniprot编号。

表2 大黄治疗便秘的生物标志物列表

2 结果与讨论

2.1 大黄治疗黄疸的代谢组学研究

实验各组的病理图、血清生化指标变化等详见课题组前期文献[19]，根据血清代谢组学分析结果获取大黄治疗黄疸的代谢生物标志物，其鉴定结果及组间变化详见表1[19]。

2.2 大黄治疗便秘的代谢组学研究

由实验各组的观察指标（图1）可以看出，大黄给药组能明显改善模型大鼠的便秘情况。对各组动物的血清进行代谢组学分析，主成分分析如图2所示，正常对照与模型组以及模型组与给药组均能有效分离，相同实验组的数据聚集性较好，表明模型建造比较成功，且给药组能够起到对模型组的治疗作用，但同时可能存在与建模机制不一致的作用机制。分别对正常对照与模型组和模型组与给药组建立OPLSDA模型，选择VIP值＞1、|P（corr）|≥0.5且组间具有显著性差异（P＜0.05，Fold change＞1.5）的生物标志物，鉴定结果及组间变化详见表2。

2.3 大黄不同疗效的生物靶标网络分析

从TCM database@Taiwan、TCMSP等中药数据库共获取86个大黄化学成分结构，经Pharmapper软件预测，筛选Score＞4.0的靶标蛋白共310个。针对大黄不同疗效的代谢组学生物标志物，经KEGG数据库检索，共收集大黄治疗黄疸的疗效靶标5个，大黄治疗便秘的疗效靶标10个，并利用DIP蛋白质相互作用数据库分别构建大黄治疗黄疸和便秘（图3）的生物靶标网络。

图1 大黄治疗便秘的相关指标检测

对比大黄治疗两种疾病的生物标志物和作用靶标（表3），可以看出大黄治疗两种疾病既有相同的作用靶标，也有各自特定的作用靶标。从相同靶标来看，大黄均能通过作用于诱导型一氧化氮合酶（P35228）、精氨酸酶1（P05089）和雌激素受体（P03372）3个蛋白调节精氨酸和谷氨酰胺代谢，进而影响机体代谢物的排泄。从特异性作用靶标来看，大黄治疗黄疸主要是通过作用于胆汁酸受体蛋白（Q96RI1），调节牛磺胆酸（C05122）、牛磺鹅去氧胆酸（C05465）和甘氨胆酸（C01921）的分泌，进而影响牛磺酸（C00245）的代谢及相关酶的活性，而由于牛黄酸和白三烯D4（C05951）的代谢均受γ-谷氨酰转肽酶1（P19440）和γ-谷氨酰转肽酶5（P36269）的影响[22]，因此大黄可能通过间接调节白三烯D4的代谢影响炎性反应；而大黄治疗便秘则主要是通过作用于支链氨基酸转氨酶（O15382）和色氨酸-tRNA连接酶（P23381）影响亮氨酸（C00123）、色氨酸（C00078）和组氨酸（C00135）的代谢，并通过作用于P450细胞色素酶CYP2C8（P10632）、CYP2C9（P11712）和磷酸激酶A2（P14555）调节亚油酸（C01595）的代谢，而这3个氨基酸和亚油酸均与肠道功能紊乱关系密切[23-25]，因此大黄可能通过调节支链氨基酸代谢起到调节肠道的目的。

由此可见，通过建立基于网络药理学和代谢组学的生物靶标网络，能够有效阐释大黄不同药效作用的作用机制，但由于药物成分靶标为预测结果，该结果仍有待进一步实验验证。

图2 大黄治疗便秘的主成分分析得分图

表3 大黄治疗黄疸和便秘的作用靶标及代谢物比较

3 结语

图3 大黄治疗黄疸（左）和便秘（右）的生物靶标网络

中药“一药多效”是其多成分、多靶标、多效应的客观反映，科学认知和评价中药的“一药多效”是阐明中药品质科学内涵的必然过程，但也是中药研究的难点。本文通过典型实例，提出并构建基于生物靶标网络的中药多效性评价方法，大大降低了常规药效学评价的复杂性和难度，有利于实现中药质量的精准质控和临床精准用药。此外，我们也应当看到，该方法的应用还面临众多问题，如方法所依赖许多数据库还不够完备，化合物的靶标预测结果存在假阳性，网络药理学无法分辨药物成分的量效差异等，因此必要的实验验证仍然不可或缺，同时也需要多学科的共同努力。

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Evaluation of the “Multi-Efficacy of One Drug” of Traditional Chinese medicines Based on the Biological Target Network: Towards Precision Medicine

Niu Ming1, Zhang Cong'en1,2, Wu Shanna1,3, Ren Yongshen4, Shi Zhuo1, Wang Jiabo1, Xiao Xiaohe1
(1. China Military Institute of Chinese Medicine, 302 Military Hospital, Beijing 100039, China; 2. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China; 3. School of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China; 4. Pharmacy College, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

“Multi-Efficacy of One Drug” (MEOD) refers to the traditional Chinese medicines (TCM) with diverse efficacies. MEOD， one of the important characteristics of TCM， is regarded as the basis of clinical rational drug use. However， there have been few reports on the MEOD research so far. In this paper， with rhubarb selected as a typical model drug， metabolomics and network pharmacology analysis are integrated to investigate the mechanisms of MEOD with the employment of the two animal models of constipation and jaundice. Then， the biological target network of MEOD is established for promoting the precision of the quality control and clinical use of TCM.

Traditional Chinese medicines， multi-efficacy of one drug， network pharmacology， metabolomics，precision medicine

10.11842/wst.2017.01.006

R28

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2017-01-10

修回日期：2017-01-10

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81274026）：“道地指数”的构建及其在中药材品质评控中的应用研究，负责人：肖小河；国家自然科学基金委青年科学基金项目（81403126）：中药“用-量关系”的探索性研究-以大黄为例，负责人：王伽伯；全军医学科技“十二五”科研项目（BWS11J049）：中国军事本草的调研整理与推广应用，负责人：肖小河；中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地开放研究基金资助项目：基于化学指纹图谱和生物效价的中药品质评控方法及应用-以大黄为例，负责人：牛明。

＊＊ 牛明与章从恩为共同第一作者。

＊＊＊ 通讯作者：肖小河，本刊编委，研究员，主要研究方向：临床中药学；王伽伯，副研究员，主要研究方向：病证毒理学。