欧李仁多肽的制备及其对DPPH自由基清除作用的研究

张 英，郭宝禹，张 玲，侯红萍

（1.山西省太谷县质量技术监督检验测试所，山西太谷 030800；2.山西省太谷中学校，山西太谷 030800；3.山西省农业科学院农产品加工研究所，山西太原 030031；4.山西农业大学，山西太谷 030800）

欧李仁多肽的制备及其对DPPH自由基清除作用的研究

张 英1，郭宝禹2，张 玲3，*侯红萍4

（1.山西省太谷县质量技术监督检验测试所，山西太谷 030800；2.山西省太谷中学校，山西太谷 030800；3.山西省农业科学院农产品加工研究所，山西太原 030031；4.山西农业大学，山西太谷 030800）

通过比较不同酶解液对DPPH自由基的清除能力，来确定最佳的欧李仁肽制备工艺。结果表明，3种酶复合水解得到的欧李仁多肽具有较好的清除DPPH自由基能力，IC50值为1.06 mg/mL。

酶解；欧李仁多肽；DPPH自由基

欧李（Cerasus humilis（Bge）Sok） 是我国特有的、古老的一种野生灌木果树，果实中矿物质含量丰富，含钙量高，也称“钙果”，为蔷薇科樱桃属。对欧李进行野生果树资源调查时发现，其具有特殊的抗旱能力，适宜在干旱地区种植，由于欧李个体小，可以作为草园栽培，与乔木果树套种可以增加收入。此外，欧李还可用于盆景、保沙固土、水果深加工、医疗保健等方面，并能获得较高的效益[1]。

欧李果仁中的蛋白含量远高于其他植物，如杏、扁桃仁、核桃中蛋白含量，其中必需氨基酸的含量占总氨基酸含量的24%[2]。现在，欧李的利用主要集中在果实的初加工，如欧李果汁饮料、欧李果醋等天然保健制品[3-6]。市场上还有一些有关欧李的深加工产品，如欧李蜜饯、糖水欧李罐头、欧李果脯等。

目前，有关对欧李仁的研究报道比较少，有人以欧李仁为原料提取营养保健油[7]，并对欧李仁中的蛋白特性进行了基础性研究[8]，但目前也只是在试验阶段。另外，还有一些对欧李仁活性成分进行提取的研究，如欧李多酚、欧李红色素[9-10]等。由于果实加工后会产生大量的欧李仁，欧李仁中所含大量有效成分的蛋白质并未得到充分的重视和利用。因此，试验以欧李仁为原料制备活性肽，为植物蛋白制备活性肽提供一定的理论依据，同时也对天然抗氧化剂和免疫调节剂的应用与开发，以及欧李资源的综合利用提供理论基础与技术支撑。

1 材料与设备

1.1 试验材料

欧李仁，山西农业大学植物园提供。

1.2 主要试剂与仪器

蛋白酶，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；氢氧化钠、盐酸，天津化工厂提供；DPPH自由基。

电子天平，JY-15A型多功能粉碎机，PHBJ-260型便携式pH计，离心机，756型紫外可见分光光度计，JDG-0.2型真空冷冻干燥机。

2 试验方法

2.1 欧李仁多肽的制备

2.1.1 欧李仁蛋白的提取

粉碎后的欧李仁用5倍的水分散，然后用1 mol/L的NaOH溶液调pH值至9.5，搅拌30 min并且保持上述pH值不变，以转速4 000 r/min离心20 min，静置后取上清液，再用1 mol/L盐酸溶液调节pH值为4，经沉淀得到蛋白。在室温下，以转速4 000 r/min离心20 min，经沉淀后用蒸馏水分散，将pH值调至7，冷冻干燥处理即可得到欧李仁蛋白。

2.1.2 欧李仁蛋白不同酶解液的制备

（1）单酶水解。各种蛋白酶在各自最合适的条件下，分别对欧李仁蛋白进行水解（3种蛋白酶分别为碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶），底物质量浓度统一规定为4%（水解条件见表1），分别收集上述3种酶在30，60，90 min后的酶解液待测。

不同种类蛋白酶的水解条件见表1。

表1 不同种类蛋白酶的水解条件

（2）双酶复合水解。首先，在最合适的条件下，将碱性蛋白酶水解30 min；然后添加胰蛋白酶，对其进行水解30 min，然后再灭酶、采集酶解液。碱性蛋白酶与中性蛋白酶按上述方法复合水解，同法中性蛋白酶与胰蛋白酶复合水解，分别收集上述3种酶解液待测。

（3）三酶复合水解。首先，在最合适的条件下，将碱性蛋白酶水解30 min，然后添加胰蛋白酶水解30 min，最后加入中性蛋白酶继续水解30 min，灭酶后收集酶解液待测。

2.1.3 不同种类的酶解液对DPPH自由基清除率的对比

按照参考文献[11]的方法，先配制125 μmoL/L的DPPH·无水甲醇溶液，然后在试管中分别加入不同的欧李仁蛋白酶解液2 mL，DPPH·（125 μmoL/L）溶液2 mL，剧烈的震荡，并静置30 min，然后在517nm处测定吸光度（Ai）。在另外2支试管中，分别加入待测液2 mL和甲醇2 mL作为对照样品（Aj），DPPH·溶液2 mL和甲醇2 mL作为空白（Ac），再按上面所述方法测定吸光度。根据下列公式分别计算出各待测样品对DPPH自由基的清除率，并且平行重复3次，再取平均值。

式中：Ai——DPPH·试剂与样品液混合液的吸光度；

Aj——空白溶剂与样品液混合液的吸光度；

Ac——空白溶剂与DPPH·试剂混合液的吸光度。

2.2 数据统计与分析

数据用SPSS软件处理，通过单因子方差分析（One-way ANOVN，LSD）进行差异显著性检验，数据以X±SD表示。

3 结果与分析

3.1 欧李仁多肽酶解法的筛选

欧李仁蛋白不同酶解液对DPPH自由基清除率的影响见图1。

图1 欧李仁蛋白不同酶解液对DPPH自由基清除率的影响

由图1可知，欧李仁蛋白经碱性蛋白酶水解后的酶解液，由于水解时间的延长，对DPPH自由基的清除率也随着逐渐上升。水解30 min后清除率为43.2%，当水解90 min后清除率可达79.1%；酶解液经胰蛋白酶水解后，由于水解时间的增加，对DPPH自由基的清除率也逐渐增加，水解90 min后清除率可达到81.4%；用中性蛋白酶水解的酶解液，于30，60，90 min后对DPPH自由基的清除率分别为64.7%，75.1%，78.7%；经碱性蛋白酶和胰蛋白酶分步复合水解后的欧李仁蛋白酶解液对DPPH自由基的清除率为80.5%；碱性蛋白酶与中性蛋白酶按上述方法复合水解酶解液的清除率达到81.2%；中性蛋白酶与胰蛋白酶复合水解后其清除率达到80.6%；但是由上述3种酶复合水解后的酶解液对DPPH自由基的清除率最高达到93.4%。因此，以DPPH自由基的清除率为指标，确定欧李仁抗氧化肽最佳酶解工艺为先将碱性蛋白酶在最适合条件下水解30 min，然后再加入胰蛋白酶水解30 min，最后再加入中性蛋白酶继续水解30 min，然后灭酶收集酶解液，再经冷冻干燥处理得到欧李仁抗氧化肽。

3.2 欧李仁多肽对DPPH自由基清除率的影响

欧李仁活性肽对DPPH自由基的清除作用见图2。

由图2可知，欧李仁活性肽质量浓度1～4 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除作用随着质量浓度的增加几乎呈直线上升；当质量浓度为4 mg/mL时，DPPH自由基清除率已达到83.3%；随着质量浓度继续升高，欧李仁多肽对DPPH自由基的清除率接近100%；而当质量浓度为8 mg/mL时，DPPH自由基清除率可达95.5%。试验所得数据用Excel进行多项式回归，回归方程为Y=-0.014 2X2+0.193 2X+0.311 1，R2=0.972 2，通过利用回归方程计算，最后得出欧李仁活性肽清除DPPH自由基的IC50值为1.06 mg/mL。

图2 欧李仁活性肽对DPPH自由基的清除作用

4 结论

试验是由碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶3种酶通过分步、复合水解欧李仁蛋白，从而使制备的欧李仁多肽具有比较好的清除DPPH自由基能力，IC50值为1.06 mg/mL。

5 讨论

通过蛋白水解获得的活性物质拥有多种生物功能，尤其以抗氧化能力最为明显。抗氧化肽类，因为其分子量小、具有高活性功能、容易被人体吸收等优点而被大范围研究。生物活性肽的抗氧化作用主要是指清除自由基的能力、抑制脂质过氧化及螯合金属离子的能力，在试验中经常利用清除DPPH自由基的能力以确定物质抗氧化活性的强弱。试验研究表明，特异性氨基酸序列和活性肽结构是决定活性肽抗氧化作用强弱的主要因素。试验对欧李仁活性肽的制备方法及其对清除DPPH自由基的作用做了初步研究，其欧李仁多肽的空间结构还有待进一步深入研究。

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Preparation and the Effect on the DPPH Free Radical of the Cerasus Humilis Kernel Peptide

ZHANG Ying1，GUO Baoyu2，ZHANG Ling3，*HOU Hongping4
（1.Taigu County Quality and Technical Supervision and Inspection Institute，Taigu，Shanxi 030800，China；2.Middle School in Taigu，Taigu，Shanxi 030800，China；3.Processing Institute，Shanxi Agricultural Science Academy，Taiyuan，Shanxi 030031，China；4.Shanxi Agricutural University，Taigu，Shanxi 030800，China）

CHKPs are prepared by hydrolysis with alkaline protease，trypsin and neutral protease followed by comparing the effects of different enzyme solution on the DPPH free radical scavenging ability to determine the best process for preparation of the CHKPs.The CHKPs can scavenge 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） （IC501.06 mg/mL）.

hydrolysis；Cerasus humilis kernel peptide；DPPH free radical

R151

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.002

1671-9646（2017）02a-0006-03

2016-12-02

张 英（1985— ），女，硕士，工程师，研究方向为食品科学。

*通讯作者：侯红萍（1965— ），女，博士，教授，研究方向为食品与发酵工程。