麝香保心丸对心肌梗死小鼠微循环障碍的作用研究

施珊岚，张艳达，贺治青，丁 茹，吴宗贵，梁 春

·基础医学论著/研究·

麝香保心丸对心肌梗死小鼠微循环障碍的作用研究

施珊岚，张艳达，贺治青，丁 茹，吴宗贵，梁 春

目的 观察麝香保心丸改善心肌梗死小鼠外周微循环障碍的作用及机制。方法 选取30只雄性C57小鼠，10只为正常对照组，其余20只心肌梗死造模后1周，予腹腔注射脂多糖30 min后，随机分为空白对照组及麝香保心丸干预组，各10只。观察各组间小鼠提睾肌微循环差异(流速及白细胞黏附)；流式分析中性粒细胞黏附分子CD11b的表达。结果 与空白对照组比较，麝香保心丸干预组可显著改善微循环障碍，并能降低白细胞黏附至微循环内皮表面，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步分析发现，药物干预组小鼠外周血中性粒细胞表面黏附分子CD11b表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 麝香保心丸可显著改善小鼠心肌梗死后微循环障碍，这可能与其抑制中性粒细胞表面黏附分子CD11b表达而减少白细胞的黏附密切相关。

心肌梗死；麝香保心丸；微循环障碍；小鼠；中性粒细胞黏附分子CD11b

心血管疾病发病率逐年上升且发病年龄年轻化，同时伴有较多危险因素(如：吸烟、高血脂、高血压、糖尿病、肥胖等)且病程漫长，可降低病人生活质量并缩短其寿命[1]。缺血性心脏病在心血管疾病中占绝大部分，其主要病因多为冠脉狭窄和阻塞。近年来，随着冠脉造影的广泛普及，缺血性心脏病所造成的心血管事件明显减少。长期随访过程发现部分病人预后欠佳，且对有心绞痛病人进行冠脉造影后，发现10%～30%病人冠脉造影提示无狭窄或轻度狭窄[2]。进一步研究发现，这类病人均伴有冠脉微循环障碍，提示冠脉微循环障碍在缺血性心脏病诊治及预后评判的重要地位，研究发现冠脉微循环障碍与不良心血管事件有密切关联[3]。

冠状动脉微循环是指冠状动脉循环中由微动脉(直径<300 μm)、毛细血管(直径5 μm～8 μm)和微静脉(直径<500 μm)构成的微循环系统[4]，它是心肌组织细胞间发生能量、物质交换的场所，是心脏行驶正常功能的保证。随着冠脉造影的广泛普及，临床医师发现冠脉造影只能检测冠脉循环5%的大血管[5]，而对冠脉循环95%微循环现阶段缺乏直接检测手段。冠脉微循环结构或功能异常称为冠状动脉微循环障碍，或称为冠状动脉微血管功能不全(coronary microvascular dysfunction，CMD)[6]，其可导致心肌缺血并引起临床相关疾病[7-8]。Pepine等[9]报道伴有胸痛而冠脉正常的189名美国女性6年随访，分析发现冠脉微循环异常人群心脑血管事件发生率较正常对照人群高3.5倍，提示冠脉微循环障碍是制约心血管病人乃至高危风险人群长期预后的因素之一。

目前国内外尚缺乏明确安全且有效的干预冠脉微循环障碍药物，近年来有学者从机制着手提出他汀类、尼可地尔、钙离子拮抗剂等有改善冠脉微循环障碍的潜质，并进行系列的基础和小规模临床研究。Sani等[10]在冠脉慢血流(CSF)病人冠状动脉内注射尼可地尔干预，发现用药后可显著改善血流分级(TIMI)血流，疗效优于硝酸异山梨酯。Arrivi等[11]研究发现，使用瑞舒伐他汀干预后，伴有冠脉慢血流的急性心力衰竭病人除改善症状外，还伴有冠脉血流速度改善及血清高敏C反应蛋白水平下降。Gunes等[12]在冠脉慢血流病人给予奈必洛尔(每日5 mg)干预3个月，发现与基线比较，病人左心室收缩和舒张功能指标均明显改善，进一步研究发现，奈必洛尔连续干预6个月后，CSF病人除血流增快外，异常升高的丙二醛、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及一氧化氮(NO)活性均显著降低[13]。

目前研究尚无大规模循证医学证据支撑且临床病人反应性偏低。麝香保心丸作为我国传统中药名方，具有芳香通温、益气强心之功效，其在冠脉慢血流临床研究中已初见疗效[14]，但相关作用机制目前尚不清楚。本研究拟采用心肌梗死(myocardial infarction，MI)后联合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导小鼠提睾肌微循环障碍模拟冠脉微循环障碍，明确麝香保心丸改善微循环障碍作用，并初步揭示其抑制白细胞作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 麝香保心丸由上海和黄药业生产(每粒22.5 mg)；LPS及罗丹明6G均购自Sigma公司(美国)。PE-标记大鼠来源的小鼠CD11b抗体购自BD Pharmingen(美国)。异氟烷麻醉剂购自深圳瑞沃德公司。

1.2 实验动物及分组 雄性C57小鼠体重18 g～22 g，由中国科学院上海药物研究所实验动物中心提供。实验前动物禁食12 h，自由饮水。选取30只雄性C57小鼠，10只为正常对照组，其余20只开胸心肌梗死造模后1周，予腹腔注射LPS(2 mg/kg)30 min后，随机分为空白对照组(MI+LPS组)及麝香保心丸干预组(MI+LPS+TCM组)，各10只。空白对照组予生理盐水；麝香保心丸干预组予24 mg/mL的麝香保心丸溶液。复方中药经研磨、生理盐水超声助溶2 h及2 000 r/min离心15 min处理，取其上清液备用，为减少潜在的溶液污染现用现配。所有干预都经舌下给药以模拟临床实际干预方式，体积为10 μL。干预后观察记录60 min。

1.3 小鼠心肌梗死造模 根据参考文献[15]进行无呼吸机支持下小鼠心肌梗死模型制备。使用异氟烷诱导麻醉小鼠，仰面固定后给予连续纯氧负载异氟烷持续麻醉，保持气体流量在0.5 mL/min，酒精消毒胸前区手术区域后，沿肋骨方向剪开皮肤及皮下组织暴露肋间隙，蚊式钳撕开肋间肌肉并顺势撑开肋间隙，暴露并挤出小鼠心脏至体外，直视下快速结扎心脏冠脉前降支，可见心前区运动消失并膨出，小心止血并回纳至胸腔，荷包缝合胸部皮肤封闭手术破口，结束手术，脱离麻醉机复苏小鼠直至其苏醒。

1.4 提睾肌微循环观察 小鼠心肌梗死后1周，使用1%戊巴比妥腹腔麻醉，LPS腹腔注射(2 mg/kg)30 min后，将小鼠固定于特制处理板，解剖固定提睾肌，在Olympus荧光显微镜BX51下进行小鼠提睾肌微循环的观察，使用高速摄像系统OLYMPUS DP71记录图像及动态视频，随后使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件，选取直径20 μm～40 μm，长度为200 μm微血管分析相关指标。使用高速摄像系统OLYMPUS DP71进行记录动态视频，使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件离线测量并记录微循环流速。选择干预后60 min进入稳态后进行分析。

1.5 白细胞黏附 在不同干预前10 min，经小鼠颈静脉注射荧光示踪剂罗丹明6G(5 mg/kg)，随后即在荧光显微镜(波长543 nm)下连续观察并经数字化记录。相关动态视频经Image Pro Plus 6.0图像分析软件离线分析。血管内白细胞附着于血管壁超过30 s定义为白细胞黏附，选择200 μm的微血管进行计数，计算每毫米黏附的白细胞数量。选择干预后60 min进入稳态后进行分析。

1.6 中性粒细胞表面黏附分子CD11b测定 在不同组别(正常对照组，MI+LPS组，MI+LPS+TCM组)经干预60 min后，颈静脉采血40 μL，肝素抗凝(20 U/mL全血)，在室温下，加入适量PE标记大鼠来源的CD11b抗体，经红细胞溶血素(BD bioscienceces Systems，USA)裂解红细胞并经生理盐水洗涤后，流式上样缓冲液重悬细胞，流式细胞仪分析中性粒细胞CD11b的平均荧光强度。

2 结 果

2.1 各组小鼠提睾肌微循环流速比较 观察期间与正常对照组小鼠比较，MI+LPS组小鼠提睾肌微循环流速显著减慢，提示造模成功，与MI+LPS组小鼠比较，MI+LPS+TCM组则可显著加快异常的提睾肌微循环流速，差异有统计学意义(P<0.05)，表明麝香保心丸可显著减轻上述病理刺激因素所诱发的微循环障碍。详见表1。

表1 各组小鼠提睾肌微循环流速比较(±s) mm/s

2.2 各组小鼠心肌梗死后微循环白细胞黏附数量比较 与正常对照组小鼠比较，MI+LPS组小鼠提睾肌微血管内白细胞黏附数目明显增多；而与MI+LPS组小鼠比较，麝香保心丸干预可显著降低微循环中白细胞的黏附，差异有统计学意义(P<0.05)，表明麝香保心丸可减轻心肌梗死联合LPS诱导下微循环障碍的白细胞黏附，但白细胞黏附至内皮细胞需要白细胞表面黏附分子的介导，药物是否通过改变其表达进而发挥作用还需要进一步验证。详见表2。

表2 各组小鼠心肌梗死后微循环白细胞黏附数量比较(±s) 个/mm

2.3 各组小鼠心肌梗死后CD11b表达的比较 与正常对照组小鼠比较，MI+LPS组小鼠外周血中性粒细胞表面黏附分子CD11b显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，这与微循环障碍程度呈显著正相关；而与MI+LPS组小鼠比较，药物干预可显著抑制中性粒细胞表面黏附分子CD11b的表达，差异有统计学意义(P<0.05)，提示麝香保心丸可显著抑制心肌梗死及LPS病理刺激下中性粒细胞的激活，降低其与微循环内皮细胞的黏附能力，这可能是该药物改善微循环障碍的潜在机制。详见表3。

表3 各组小鼠心肌梗死后CD11b表达的比较(±s)

3 讨 论

微循环是全身血液循环的重要组成部分，对各组织脏器血供及功能代谢起重要作用。微循环障碍参与多种疾病的病理过程，其中炎症反应及血管内皮损伤可引起机体心、肺、肝、肾等多器官功能障碍，继而成为病人致残，乃至死亡的重要病因之一[16]。CMD是引起的心肌缺血的常见病因之一。根据合并基础疾病可分为4种类型：无心肌病及阻塞性冠心病的CMD；伴有心肌疾病的CMD；伴有阻塞性冠心病的CMD和医源性CMD[17]。本研究通过LPS诱导下小鼠心肌梗死后提睾肌微循环的连续变化进行多指标动态观察，证实麝香保心丸可改善LPS联合心肌梗死后小鼠提睾肌微循环障碍，表现为促进微循环流速，抑制白细胞黏附至内皮及在内皮表面游走；进一步研究发现麝香保心丸可调控中性粒细胞黏附分子CD11b、CD62L表达，提示这可能是芳香类复方中药改善微循环障碍的机制之一。

细胞黏附是机体基本现象之一，其在信息传递及细胞凋亡、炎症、免疫、动脉硬化、肿瘤转移与组织损伤愈合等诸多病理生理过程发挥重要作用。细胞黏附分子是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合分子的统称。黏附分子以受体-配体结合的形式发挥作用，使细胞与细胞间，细胞与基质间，或细胞-基质-细胞间发生黏附，参与细胞识别、活化与信号传递、增殖与分化、伸展与移动，是免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移等众多病理生理过程的分子基础。黏附分子根据其结构特点可分为免疫球蛋白超基因家族、整合素家族、选择素家族、钙粘素家族等。在诸多冠脉微循环障碍研究中发现此类病人的炎性标记物显著增高，提示炎性反应可能参与CMD的病理过程[18]，而中性粒细胞与内皮细胞黏附是炎性血管损伤的关键一步。中性粒细胞表面的黏附分子通过细胞间游走及黏附固定介导激活血管内皮及后续的炎性血管损伤。活化的中性粒细胞可穿过血管壁向组织聚集移行加重血管内皮损伤，中性粒细胞首先聚合，之后在局部小血管内皮细胞滚动，参与该过程的主要黏附分子是CD62L(L-selectin)与血管内皮细胞表面的E-selectin。聚合的白细胞受内皮细胞和细胞外基质产生的细胞因子和内皮细胞表面分子的刺激而活化，进一步上调中性粒细胞表达CD11b/CD18，提高中性粒细胞与内皮细胞黏附性，转而固定乃至穿透内皮细胞层至组织。因此，抑制中性粒细胞的活化效应，阻断或降低中性粒细胞与内皮细胞的黏附，是改善微循环障碍的关键环节。

冠脉微循环障碍根据其证候特点可将其归属于“胸痹心痛”范畴，其病机属心络受阻、血瘀阻络、络脉绌急[19]。微动脉、微静脉、毛细血管在中医学中可归于络，心络类似冠脉微循环。“胸痹心痛”可由正气亏损，痰浊、瘀血、气滞、寒凝等病理产物阻于心脉而引发。治疗原则应先治其标，后顾其本，或标本同治，虚实兼顾。治标常以化痰、活血、行气、散寒为主，扶正固本包括温阳、补气、益气养阴等法。活血化瘀作为基本治法。在活血化瘀治疗理念下，CMD导致的心肌缺血可有望通过中医药进行干预。与西药比较，中医药具有多方面、多靶点和个体化治疗优势。丹红注射液干预冠脉慢血流病人试验，发现丹红注射液可明显提高冠脉血流速度，增加冠脉血流贮备，并显著减少运动平板实验ST段压低[20]，具有改善冠状动脉微血管功能障碍作用。Li等[21]在复方丹参滴丸干预微循环障碍小鼠研究中证实可抑制白细胞渗出、增加微血管血流速度、改善血管内皮功能。中医药干预冠脉微循环研究逐渐增多且均取得可喜结果[22-24]，证实中医药在改善冠脉微循环方面具有较大的优势。

麝香保心丸源自宋代《太平惠民和剂局方》之名方苏合香丸，其由麝香、蟾酥、人参、牛黄、肉桂、冰片和苏合香等7味中药组成，具有芳香开窍、理气止痛的功效。按照中医君、臣、佐、使的原则组方，基础药理学研究证实，麝香和蟾酥具有强心及扩张血管功效；人参具有正性肌力、抗氧化及降血脂作用；肉桂有散寒止痛、活血化瘀作用；牛黄则拥有消炎镇静、退热及抗惊厥等功效；苏合香脂及冰片则能缓解心率和解除冠状动脉痉挛[25]。大量研究表明：麝香保心丸具有保护血管内皮、促进血管新生、减轻心脏炎症反应及阻碍动脉粥样硬化进展等作用[26]，在治疗冠心病方面具有确切的临床疗效。

本研究发现：麝香保心丸可抑制中性粒细胞表面黏附分子CD11b表达，进而降低白细胞在微循环中黏附，这可能是其改善心肌梗死及脂多糖双重病理因素诱发微循环障碍的潜在机制。本研究仅仅从白细胞黏附方面进行初步探讨，由于复方中药的作用靶点和机制较为复杂，是否还存在其他麝香保心丸改善微循环障碍的机制还有待进一步深入研究。

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(本文编辑薛妮)

Protective Effects of Shexiang Baoxin Pills on Microcirculation Dysfunction in Mice with Myocardial Infarction

Shi Shanlan，Zhang Yanda，He Zhiqing，Ding Ru，Wu Zonggui，Liang Chun

Shanghai Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China.

Liang Chun

Objective To explore the protective effects of Shexiang Baoxin pills (SXBXP) on microcirculation dysfunction in mice with myocardial infarction and its mechanism.Methods Thirty male C57 mice were used，of which 10 mice were chosen as normal control group and 20 mice were given myocardial infarct operation.After one week of operation，20 mice were intraperitoneal injected with LPS and then randomized into control group (n=10) and SXBXP group (n=10).The changes of microcirculation were recorded and investigated，such as microcirculation flow velocity and white blood cells' adhesion.The expression of CD11b in neutrophil was analyzed with flow cytometry.Results Compared with control group,the microcirculation dysfunction was alleviated and the number of white blood cells' adhesion to endothelial cells was decreased in SXBXP group (P<0.05).The expression of CD11b in neutrophil was decreased in SXBXP group (P<0.05).Conclusion SXBXP can improve the microcirculation dysfunction in mice with myocardial infarction，which might be partly attributed to inhibiting the expression of CD11b in neutrophil.

myocardial infarction;Shexiang Baoxin pills；microcirculation dysfunction；mouse；neutrophil adhesion molecule CD11b

国家自然科学基金(No.81130065，2014ZX09301307-016，81473445，91539118)；上海市科委中医引导性项目(No.15401931500)

第二军医大学附属长征医院(上海 200003)

梁春，E-mail：chunliangliang@hotmail.com

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.05.009

1672-1349(2017)05-0547-05

2016-12-21)

引用信息：施珊岚，张艳达，贺治青，等.麝香保心丸对心肌梗死小鼠微循环障碍的作用研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(5)：547-551.