肉制品致病菌多重PCR快速检测技术研究

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肉制品致病菌多重PCR快速检测技术研究

肉类工业是我国第一大食品产业，关系国计民生。肉制品营养丰富，在加工、包装、储藏等过程中极易受致病性微生物的污染，从而引发肉品安全问题。沙门氏菌、小肠耶尔森氏菌和大肠杆菌O157：H7是常见的引起肉制品污染的重要致病菌。近年来兴起的PCR技术以其特异性强、敏感性好，方便、快速等优点逐渐应用于食品检验领域。但PCR方法每次试验只能特异性的检测一种病原菌，而实际样品中往往存在种类繁多的病原细菌，涉及不同种和型别。多重PCR是在普通PCR基础上针对这一不足改进并发展起来的，在同一个反应中同时完成多个基因扩增的一种快捷检测方法。

中国专利CN201310191453.2公开了一种猪肉中5种主要致病菌五重PCR快速检测方法。该方法是先提取待测肉样中总细菌DNA，然后合成SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示引物；进行五重PCR反应，PCR产物用2%琼脂糖进行电泳分析，根据电泳结果进行判断。用该发明方法检测猪肉中种食源性致病菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌O157:H7)的最低检测限分别为142、51、9、33 cfu/mL和670 cfu/mL，适合食品行业对大批量猪肉及猪肉产品在销售过程中致病菌的日常安全监测。CN201410532170.4公开了一种牛肉中3种主要致病菌多重PCR检测方法，该方法包括：沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7的菌株培养；不同增菌液对3种致病菌的增菌效果对比；选择引物；多重PCR扩增体系；提取待测牛肉样品中细菌的DNA；建立多重PCR反应体系参数。该发明的3种主要致病菌多重PCR检测方法，不仅保留了常规PCR的高特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测多种微生物的目的，大大节省了时间，节约了经费开支。CN201210130290.2公开了同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法。所述的荧光定量PCR引物和探针共有5组，可以分别检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、福氏志贺氏菌和非O1群霍乱弧菌，除单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌基因2组的引物和探针不能同时使用外，其他任意2组或2组以上组合，均可以同时检测相应引物和探针对应能检测出的致病菌。该发明同时公开了一种利用上述各引物对和探针建立的多重荧光定量PCR扩增体系，可快速准确地检测出待检样品中是否有相应致病菌，操作方便快捷，且特异性高，不会出现假阳性结果，可以做成试剂盒等，在农副产品致病菌检测中非常适用。李新福等（2017）针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌等有害微生物，利用多重聚合酶链式反应(m-PCR)的方法，对3种菌同时快速检测，从而达到节省时间，提高效率的目的。使用沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的Prf4基因和单增李斯特菌nuc基因设计3对特异性引物，在确定特异性引物的基础上，将3种菌进行培养增菌后接种于低温肉制品中，过夜富集后收集并进行灵敏度检测，优化多重PCR反应体系并应用于实际样品的检测。结果表明：多重PCR方法在同时检测这3种有害微生物时,m-PCR最佳反应条件如下:25 μL反应体系、10×PCR缓冲液2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、2.5 U/μL 的 DNA 聚合酶 0.5 μL 及上、下游引物各 0.5 μL、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的模板 1.0 μL、沙门氏菌的模板2.0 μL,加ddH2O补足至25 μL,最佳退火温度为64℃。胡瑞丽等（2015）根据单核增生李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7的特异性序列分别设计4对特异性引物，建立了一种快速检测上述4种常见食源性致病菌的多重PCR方法，并对反应体系中的模板、引物、rTaq酶、MgSO4添加量以及退火温度进行了优化。结果显示：4对引物序列的特异性均较好，利用单重PCR对4种致病菌的灵敏度进行检测，其检测限均达到103copies/mL。多重 PCR同时检测4种致病菌的灵敏度为103copies/mL，对人工污染猪肉中的4种致病菌的灵敏度检测为103cfu/mL。该检测方法不与其他菌产生交叉反应，与传统方法相比大大缩短了检测时间，并提高了检测的准确度。

食源性致病菌导致的疾病和食品污染已成为世界卫生问题。研究建立高效、精确、特异性强、灵敏度高的检测技术对于食品安全和人体健康具有重要的作用，具有很好的实用价值和开发前景，可在食品检测领域大力推广。

（江南大学图书馆 张群）