脱氧雪腐镰刀菌烯醇的高灵敏化学发光磁酶免疫法检测*

丁丽华，于 斐，张冠军，熊亚敏，刘利娥#，吴拥军，玉崧成

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)郑州大学公共卫生学院卫生化学教研室 郑州 450001

脱氧雪腐镰刀菌烯醇的高灵敏化学发光磁酶免疫法检测*

丁丽华1)，于 斐2)，张冠军1)，熊亚敏1)，刘利娥2)#，吴拥军2)，玉崧成2)

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)郑州大学公共卫生学院卫生化学教研室 郑州 450001

#通信作者,女，1966年12月生，博士，教授，研究方向：食物营养与新型分析技术，E-mail：zzdxlle66@zzu.edu.cn

脱氧雪腐镰刀菌烯醇；金磁复合微粒；化学发光磁酶免疫法

目的：建立一种快速简便、灵敏度高的新型化学发光磁酶免疫法(MECLIA)检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。方法：制备Fe3O4@SiO2@Au金磁复合微粒及DON与卵清蛋白(OVA)的复合物(OVA-DON)；以Fe3O4@SiO2@Au为固相载体，优化条件，使其表面负载OVA-DON形成DON金磁免疫复合微粒；以鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶-苯酚类化合物作为增强化学发光体系，建立MECLIA对小麦中DON进行检测，并对所建立的方法进行方法学评价。结果：该方法标准曲线方程为Y=-521 951X+2 883 979(X为DON质量浓度的对数，Y为化学发光值，R2=0.998 6)，线性范围为0.10～20.00 μg/L，检测限为31 ng/L；批内RSD为2.2%～3.5%，批间RSD为4.9%～9.6%，标准样品回收率为95.0%～108.0%，小麦样品回收率为92.0%～106.0%。结论：该研究建立的MECLIA灵敏度高、精密度好、操作简单，可用于大批量小麦样品中DON的快速检测。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素,是由黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌和燕麦镰刀菌等产生的具有强细胞毒性、胚胎毒性和潜在致癌性的真菌毒素[1]，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物。DON性质稳定，一般的食品加工很难将其破坏，对动物和人类的健康危害非常大。因此建立一种灵敏度高、简便快速的DON检测方法是农产品生产过程监控、现场检测、快速筛查和维护人体健康的迫切需求。常用的DON检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、侧流免疫层析法(LFA)[2]、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱-质谱法(GC-MS)[3]等，这些方法或灵敏度较低，或分析时间长、步骤繁琐[4]，或仪器设备昂贵[5-6]，不能满足快速检测DON的需求。化学发光酶联免疫分析方法(CLEIA)是将化学发光和免疫反应相结合的一种新型检测方法，不仅具有检测快速、操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，而且对仪器要求低，适合大批量样品的现场筛查，但该法存在着包被抗体(或抗原)易脱落、固液接触面积小、反应速度慢等缺陷。为弥补CLEIA的不足，该研究利用金磁复合微粒代替传统的微孔板作为固相载体，建立化学发光磁酶免疫分析法(magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay，MECLIA)用于DON的检测，为食品中DON毒素的检测提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 卵清蛋白(OVA)、DON标准品购自Sigma公司，DON单克隆抗体(以下简称DON单抗，购自北京华安麦科生物技术有限公司)，HRP标记的羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，鲁米诺(阿法埃莎化学有限公司)。实验所用试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q水。化学发光底液A(鲁米诺+对羟基联苯)和B(过氧化氢)为作者所在实验室自制；缓冲溶液采用文献[7]报道的方法配制。纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano-zs 90，英国马尔文仪器有限公司)，红外光谱仪(PE-1710，西德PE公司)，化学发光免疫分析仪(Centro XS3 LB960，BERTHOLD公司)，紫外可见分光光谱仪(UV-1601，日本岛津公司)。

1.2 MECLIA方法原理 MECLIA法检测DON的原理如图1所示，以金磁复合微粒为固相载体负载DON-OVA复合物形成DON金磁免疫复合微粒；然后加入待测样品和DON单抗，待测样品中的DON和固相DON竞争结合DON单抗；磁分离后加入HRP标记的羊抗鼠IgG；再次磁分离，最后加入化学发光底液A和B，HRP催化发光底液产生化学发光；发光强度与待测样品中DON含量成反比。

1.3 DON金磁免疫复合微粒的制备 用共沉淀法[8]制备Fe3O4磁性微粒，在此基础上参考文献[9]的方法制备金磁复合微粒Fe3O4@SiO2@Au，用纳米粒度及Zeta电位、红外光谱对其进行表征测定。参考文献[10]的方法制备DON-OVA人工抗原，用紫外吸收光谱进行表征测定。利用金磁复合微粒良好的表面相容性负载DON-OVA形成DON金磁免疫复合微粒，具体步骤如下：将5.00 mg金磁复合微粒与1 mL 1.233 μmol/L DON-OVA人工抗原分别加入1 mL 20 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液中，在优化后的条件(反应温度37 ℃、作用时间30 min)下恒温振荡，磁分离；再加入800 μL 封闭液，37 ℃、300 r/min振荡1 h，磁分离，用PBST洗板3次，得到DON金磁免疫复合微粒；最后加入1 mL保存缓冲液(10 mmol/L PBS)混匀，4 ℃保存备用。

图1 MECLIA法检测DON原理图

1.4 MECLIA检测DON方法的建立 用碳酸盐缓冲溶液将DON金磁免疫复合微粒按1100稀释，将稀释后的悬浮液加入96孔板中，每孔100 μL，用PBST洗涤1次。每孔加入300 μL封闭液，37 ℃孵育1 h，用PBST洗板2次。每孔再加入100 μL DON与其单克隆抗体的混合液，37 ℃孵育1 h，用PBST洗板3次。随后每孔加入100 μL用封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h后用PBST洗板4次。最后每孔再加入发光底液A和B各100 μL，检测各孔的化学发光值。 配制质量浓度分别为0.05、0.10、0.50、1.00、10.00、20.00 μg/L的DON标准溶液，按上述方法进行检测，以化学发光值为Y，以DON质量浓度的对数为X，绘制标准曲线。

配制0.1、5.0、20.0 μg/L的DON标准品稀释液，每个浓度设6个平行对照，在3个96孔板中分别进行MECLIA检测，测定DON浓度，计算相对标准偏差(RSD)，考察批内精密度和批间精密度。

配制0.1、5.0、20.0 μg/L的DON标准品稀释液，进行MECLIA实验，测定化学发光值，代入标准曲线得到相应的DON浓度，计算加标回收率。

1.6 小麦样品检测 将小麦样品用高速万能粉碎机粉碎，过300目筛，用4分法称取5 g样品，用10 mL甲醇-水(体积比为31)溶液振荡提取30 min，离心15 min，过滤后用PBS稀释，采用MECLIA方法测定DON浓度。

在离心管中加入1 mL样品稀释液后分别加入1.0、5.0和15.0 μL 1.0 mg/L DON标准品溶液，采用MECLIA方法检测DON浓度，计算加标回收率。

2 结果

2.1 金磁复合微粒的表征 ①纳米粒度及Zeta电位：Fe3O4、Fe3O4@SiO2-NH2、Fe3O4@SiO2@Au的粒径及Zeta电位分析结果见表1。表1说明，3种磁性微粒的分散性和稳定性较好。②红外表征：如图2所示，与Fe3O4红外光谱图相比，Fe3O4@SiO2@Au在3 404.39、1 617.62 cm-1处有N-H和O-H伸缩振动和弯曲振动产生的吸收峰；在1 061.93、1 112.11 cm-1处有Si-O反对称伸缩振动产生的吸收峰。上述结果提示Fe3O4@SiO2@Au金磁复合微粒制备成功。

表1 磁性微粒的粒径及Zeta电位

图2 磁性微粒的红外吸收光谱图

2.2 DON金磁免疫复合微粒的制备 DON-OVA人工抗原紫外吸收光谱表征:图3显示，在280 nm处OVA有吸收峰；在345 nm处DON有吸收峰。DON-OVA人工抗原在280和345 nm附近均有吸收峰，提示偶联成功。

图3 DON-OVA的紫外吸收光谱图

2.3 MECLIA标准曲线及方法学评价 MECLIA法检测DON的标准曲线为Y=-521 951X+2 883 979(X为DON质量浓度的对数，Y为化学发光值)，R2=0.998 6，线性范围为0.10～20.00 μg/L。该方法的检测限为31 ng/L；批内RSD为2.2%～3.5%(n=6)，批间RSD为4.9%～9.6%(n=6)；标准品的回收率范围为95.0%～108.0%。

2.4 MECLIA法检测小麦样品 MECLIA法测得小麦样品稀释液中DON浓度为1.5 μg/L。加标回收率见表2，回收率范围为92.0%～106.0%。

表2 MECLIA法加标回收率(n=3)

3 讨论

该研究用金磁复合微粒代替传统微孔板作为固相载体建立了一种简便快速的MECLIA检测小麦中DON残留。其灵敏度显著高于传统的CLEIA法，检测限为31 ng/L。Li等[11]运用传统免疫分析方法检测DON，检测限为6.12 μg/L，改良后LOD仍为0.94 μg/L。该方法灵敏度较高原因在于利用金磁复合微粒替代传统的微孔板作为固相载体，避免了传统免疫分析中由于抗体(或抗原)扩散脱落而引起的检测结果不准确；增大了固液接触面积，提高了免疫反应速率，使反应更彻底；此外，金磁复合微粒在一定程度上也起到了信号增强的作用[12]。

总之，该研究所建立的方法精密度好，回收率高，准确性较好；且样品前处理简单、操作方便，耗时短，可用于大批量小麦样品中DON的检测，有望实现DON的现场快速检测。

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(2016-07-28收稿 责任编辑徐春燕)

Determination of deoxynivalenol by a sensitive method of magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay

DINGLihua1),YUFei2),ZHANGGuanjun1),XIONGYamin1),LIULi'e2),WUYongjun2),YUSongcheng2)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofSanitaryChemistry,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

deoxynivalenol;gold magnetic partical;magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay

Aim: To propose a magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay(MECLIA) for rapid and sensitive detection of deoxynivalenol(DON).Methods: Fe3O4@SiO2@Au particles and the conjugation of DON to ovalbumin(OVA-DON) were prepared.Then,the DON-OVA was coated on the surface of Fe3O4@SiO2@Au by using Fe3O4@SiO2@Au as immobile phase. After that, MECLIA based on the luminol-H2O2-HRP-phenols system for detection of DON was established. The accuracy and sensitivity of the established method were evaluated.Results: The standard curve equation wasY=-521 951X+2 883 979(Xwas the logarithm of the concentration of DON,Ywas the illumination value of the standard concentration,R2=0.998 6), the linear range was 0.10～20.00 μg/L, the limit of detection was 31 ng/L, the relative standard deviations were less than 3.5% and 9.6% for intra- and inter-assay, respectively, and the recoveries ranged from 95.0% to 108.0%. The proposed method was satisfactorily applied to determine DON in wheat sample and the recoveries ranged from 92.0% to 106.0%.Conclusion: The developed MECLIA is sensitive and simple with good precision for DON residue analysis in wheat samples.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.007

*国家自然科学基金青年项目 81402721；河南省教育厅自然科学基础研究项目 14A330008；2014郑州大学研究生教育科研专项基金资助项目

R155.5+2