重症肌无力患者肌细胞中LRP4胞内区与SNX17的相互作用*

安 颖，吕 杰,张迎娜,高 峰#，张 婧,方 华,李倩如，杜 英，张清勇，王金兰#，

张运克5)

1)郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014 2)郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室 郑州 450052 3)郑州大学基础医学院免疫学系 郑州 450001 4)郑州大学第二附属医院普胸外科 郑州 450014 5)河南中医药大学康复医学院康复办公室 郑州 450000

重症肌无力患者肌细胞中LRP4胞内区与SNX17的相互作用*

安 颖1)，吕 杰2),张迎娜2),高 峰2)#，张 婧2),方 华2),李倩如3)，杜 英3)，张清勇4)，王金兰1)#，

张运克5)

1)郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014 2)郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室 郑州 450052 3)郑州大学基础医学院免疫学系 郑州 450001 4)郑州大学第二附属医院普胸外科 郑州 450014 5)河南中医药大学康复医学院康复办公室 郑州 450000

#通信作者：高峰，男，1970年12月生，在读博士，研究员，研究方向：神经免疫病机制与临床，E-mail：gaoyuanshan@126.com；王金兰，女，1968年9月生，博士，主任医师，研究方向：脑血管病及自身免疫性疾病，E-mail：wangjinlan08@126.com

低密度脂蛋白受体相关蛋白4；分拣微管连接蛋白17；重症肌无力；免疫共沉淀

目的：探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)和分拣微管连接蛋白17(SNX17)在重症肌无力(MG)患者肌细胞中相互作用关系。方法：分别构建原核表达载体pET30a-LRP4胞内区和真核表达载体pEASY-Blunt M2-SNX17，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达相对分子质量约为17 800的His-LRP4胞内区，在HEK293T细胞中诱导表达相对分子质量约为53 000的Myc-SNX17。利用抗Myc单克隆抗体磁珠与抗His单克隆抗体磁珠进行双向免疫共沉淀(Co-IP)，以验证LRP4、SNX17两种蛋白分子是否存在相互作用。结果：成功构建了原核表达载体pET30a-LRP4胞内区和真核表达载体pEASY-Blunt M2-SNX17； 抗Myc单克隆抗体磁珠与His-LRP4混合后不发生共沉淀，如再与Myc-SNX17 混合则可发生共沉淀；抗His单克隆抗体磁珠与Myc-SNX17混合后不发生共沉淀，再与His-LRP4胞内区混合可发生共沉淀。结论：原核表达的LRP4胞内区蛋白与真核表达的SNX17体外可发生直接结合。

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种主要累及神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)突触后膜的自身免疫性疾病[1]，主要病理特征是突触后膜乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)数量减少、结构变化导致的终板膜崩解。有研究[2]结果显示，低密度脂蛋白受体相关蛋白4(low density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4)与肌肉特异性受体酪氨酸激酶(muscle specific kinase，MuSK)、烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic Acetylcholine receptor ，nAChR)一起组成了NMJ终板膜特有的功能单元LRP4-MuSK-nAChR，该功能单元在神经肌肉兴奋化学传递的过程中发挥了重要作用。课题组[3]前期发现MG患者肌肉组织分拣微管连接蛋白17(sorting nexin 17，SNX17)含量明显增高，并证实该分子与AChR共定位于NMJ。SNX17是细胞分拣微管连接蛋白家族成员，主要作用是通过其FERM-like基元与低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)、LRP1、P选择素和载脂蛋白2(the ε2 isoform of ApoE，ApoER2)等多种膜蛋白胞内域天冬酰胺-脯氨酸-X-酪氨酸(NPxY)基元结合，促进这些膜蛋白高效率循环再利用到细胞膜[4-5]。生物信息学分析显示，LRP4与LRP1、LDLR等同属于低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)家族，具有类似的NPxY基元，因此，SNX17与LRP4存在相互作用的可能，可使LRP4逃避溶酶体降解，促进LRP4在胞内的循环利用[6]。为验证这一推测，作者通过分别表达LRP4胞内区和SNX17，采用双向免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)法明确两者之间的相互作用关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 肌肉标本取自2015年1月在郑州大学第二附属医院胸外科行胸腺切除术治疗的MG患者的第二肋间，质量约60 mg，取出后立即保存于液氮中。MG诊断参考文献[7]的标准，根据病史、体征、疲劳试验和新斯的明试验确诊，手术时机选择参考文献[8]。患者均签署知情同意书，该研究由郑州大学伦理审查委员会批准。质粒pMD18T、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA连接酶、反转录试剂盒购自TaKaRa公司，质粒pET30a购自Novagen公司，pEASY-Blunt M2表达载体购自北京全式金生物技术有限公司，Turbo8.0转染试剂、羊抗人LRP4胞内区抗体、辣根过氧化物酶标记鼠抗羊单克隆抗体、抗Myc单克隆抗体磁珠购自Origene公司，鼠抗人SNX17抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司， 抗His单克隆抗体磁珠购自MBL医学生物研究所，pET30a-SNX17及大肠杆菌DH5α、Trans1-T1、BL21(DE3)、HEK293T细胞均由郑州大学医药科学研究院神经免疫学研究室保存。

1.2 His-LRP4胞内区蛋白的表达及鉴定

1.2.1 质粒pMD18T-LRP4胞内区的克隆及鉴定 从MG患者肌肉标本中提取总RNA，用试剂盒反转录成cDNA。以LRP4胞内区基因(GenBank编码：NM_002334.3 第5 482～5 891位)为模板设计引物，上游引物序列：5’-GGAATTCCATATGTACAGA CACAAAAAATCCAAGTTCAC-3’，下游引物序列：5’-CCGCTCGAGGACCTGGCTCTCTGAGGAG-3’；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR扩增出LRP4胞内区，用T4 DNA连接酶与质粒pMD18T连接，16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，同时以空质粒和灭菌双蒸水转化作对照，涂布于含有氨苄青霉素的LB选择培养基，37 ℃培养12～18 h，挑取单克隆至5 mL LB选择培养基，37 ℃ 180 r/min培养过夜，经菌落PCR和酶切鉴定，将阳性克隆送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.2.2 原核表达载体pET30a-LRP4胞内区的构建

用NdeⅠ、XhoⅠ分别酶切质粒pMD18T-LRP4胞内区和表达载体pET30a，切胶回收目的基因片段和载体片段，连接、转化及鉴定方法同1.2.1。

1.2.3 His-LRP4胞内区蛋白的表达及鉴定 将测序正确的质粒pET30a-LRP4胞内区转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB选择培养基上，37 ℃培养12～16 h。挑取单克隆接种于25 mL含有50 mg/L 卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，次日取菌悬液1 mL接种于100 mL新鲜的LB培养基中，37 ℃ 180 r/min 培养，至OD(600 nm)为0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L，30 ℃诱导4 h，收集菌液，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬，冰浴超声破碎，离心收集上清液后使用BIO-RAD蛋白纯化仪进行纯化。

1.2.4 His-LRP4胞内区蛋白的鉴定 纯化完成的His-LRP4胞内区蛋白经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后观察。将电泳后的凝胶转移至硝酸纤维素膜上，30 g/L的BSA封闭2 h，加入按12 000稀释的羊抗人LRP4胞内区抗体，4 ℃孵育过夜，次日摇床上用TBST缓冲液洗涤3次，10 min/次；再加入按16 000稀释的辣根过氧化物酶标记鼠抗羊单克隆抗体，摇床上室温孵育2 h，用TBST 洗涤3次，10 min/次，暗室中ECL曝光1 min后进行显影和定影。

1.3 Myc-SNX17蛋白的表达及鉴定

1.3.1 真核表达载体pEASY-Blunt M2-SNX17的构建 以SNX17基因序列为模版设计引物。上游引物序列：5’-ACCACCATGGTGCACTTTTCCATTCCCGA AACCG-3’，下游引物序列：5’-CAGATCCTCATCTCC AATGCCCTCG-3’；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。从pET30a-SNX17扩增出SNX17片段，将扩增出的片段与pEASY-Blunt M2表达载体进行连接，转化到Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的LB选择培养基，37 ℃培养12～18 h，挑取单克隆进行鉴定。连接、鉴定方法同1.2.1。

1.3.2 Myc-SNX17的表达及鉴定 将在6孔细胞培养板中培养24 h的HEK293细胞培养上清用移液器轻轻吸出，然后沿孔壁缓慢加入2 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，静置待用。按每孔加100 μL脂质体质粒混合液计算转染需要的总体积，然后取相应体积的无血清RPMI 1640培养液，按3 μL/孔加入Turbo8.0转染试剂，轻轻混匀，静置5 min，再按1 μg/孔加入重组质粒pEASY-Blunt M2-SNX17，轻轻混匀，静置30 min，转染空质粒作对照，然后将准备好的转染试剂和重组质粒的混合液按100 μL/孔加入相应的培养孔中，轻轻晃动培养板使其混合均匀，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养72 h。收集细胞，加入细胞裂解液RIPA和细胞蛋白酶抑制剂PMSF冰上裂解30 min， 4 ℃ 12 000 r/min 离心15 min，去除细胞碎片，收获细胞裂解上清，进行SDS-PAGE电泳检测，Western blot法验证Myc-SNX17的表达。

1.4 SNX17与LRP4相互作用的双向Co-IP鉴定

取50 μL磁珠置于1.5 mL EP管中，用RIPA洗3次，向其中加入200 μL LRP4胞内区蛋白质(2.6 g/L)和50 μL SNX17(3.8 g/L)，充分混匀，4 ℃孵育过夜。然后将装有磁珠样品混合物的EP管置于磁力架上，静置30～60 s，弃去所有溶液，RIPA洗3次，然后向其中加入20 μL 5×SDS上样缓冲液，充分混匀后95 ℃煮沸10 min，12 000 r/min 4 ℃离心4 min，收集上层溶液进行SDS-PAGE电泳，后进行Western blot鉴定。

2 结果

2.1 His-LRP4胞内区的表达及鉴定结果 原核表达载体pET30a-LRP4胞内区单酶切、双酶切结果符合预期(图1A)，BL21(DE3)/pET30a-LRP4胞内区诱导表达后出现LRP4条带(图1B)，提示pET30a-LRP4构建成功，质粒图见图1C；Western blot结果证实BL21(DE3)/pET30a-LRP4胞内区诱导表达的蛋白是His-LRP4胞内区(图1D)。

A：pET30a-LRP4胞内区(0)、单酶切(1)、双酶切(2)电泳；B：BL21(DE3)/pET30a-LRP4胞内区未诱导表达(0)和诱导表达(1)的蛋白；C：pET30a-LRP4胞内区质粒图；D：Western blot验证BL21(DE3)/pET30a-LRP4胞内区未诱导(0)与诱导后(1)LRP4胞内区的表达。图1 His-LRP4胞内区的表达与鉴定

2.2 Myc-SNX17的表达及鉴定结果 琼脂糖凝胶电泳显示成功扩增出SNX17(图2A)，从HEK293T/pEASY-Blunt M2与HEK293T/pEASY-Blunt M2-SNX17细胞中提取的总蛋白差异不大(图2B)，质粒图见图2C；Western blot结果证实从HEK293T/pEASY-Blunt M2-SNX17细胞中提取的总蛋白含Myc-SNX17(图2D)，提示成功构建pEASY-Blunt M2-SNX17。

A： SNX17基因扩增；B： HEK293T/pEASY-Blunt M2(0)和HEK293T/pEASY-Blunt M2-SNX17(1)细胞中提取的总蛋白；C：pEASY-Blunt M2-SNX17的质粒图；D：Western blot验证细胞HEK293T/pEASY-Blunt M2(0)与HEK293T/pEASY-Blunt M2-SNX17(1)细胞中SNX17的表达。图2 Myc-SNX17的表达与鉴定

2.3 LRP4与SNX17相互作用的鉴定结果 抗Myc单克隆抗体磁珠与His-LRP4胞内区混合后未沉淀出LRP4胞内区，如再与Myc-SNX17 混合同时沉淀出SNX17与LRP4胞内区(图3)。抗His单克

隆抗体磁珠与Myc-SNX17混合后未沉淀出SNX17，再与His-LRP4胞内区混合则同时沉淀出SNX17与LRP4胞内区(图4)。

M：Marker；1：His-LRP4胞内区；2：Myc-SNX17；3：抗Myc单克隆抗体磁珠；4：抗Myc单克隆抗体磁珠+His-LRP4胞内区；5：抗Myc单克隆抗体磁珠+ His-LRP4胞内区+Myc-SNX17。图3 抗Myc单克隆抗体磁珠介导的Co-IP电泳图(A)及Western blot图(B)

M：Marker；1：His-LRP4胞内区；2：抗Myc单克隆抗体磁珠+Myc-SNX17；3：抗His单克隆抗体磁珠；4：抗His单克隆抗体磁珠+Myc-SNX17；5：抗His单克隆抗体磁珠+Myc-SNX17+His-LRP4胞内区。图4 抗His单克隆抗体磁珠介导的Co-IP电泳图(A)及Western blot图(B)

3 讨论

MG是自身抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与的以NMJ信号传递障碍为特征的一种自身免疫性疾病。MG主要有两种病理变化：一是胸腺异常[9]，二是NMJ突触后膜(终板膜)AChR数量减少[10]；主要涉及三种抗体：AChR抗体、MuSK抗体和LRP4抗体[11]。LRP4属LDLR家族中的一员，通常情况下，LRP4作为受体蛋白与突触前膜运动神经元纤维末梢分泌的聚集蛋白结合，促进MuSK发生酪氨酸磷酸化，诱导nAChR聚集于终板膜，更好地接收来自突触前膜的神经递质乙酰胆碱，传导神经冲动[12-13]。LDLR家族拥有相似的蛋白质结构和膜拓扑学特征，最先发现的LDLR家族成员是作为LDL细胞内化的膜受体。有研究[14]显示，在LDL与LDLR结合诱发细胞内化过程中，位于初级内体的SNX17可与LDLR胞内区域结合，引导LDLR逃避溶酶体降解，重新回到细胞膜发挥受体的功能，从而加速细胞对LDL的摄取。

LRP4位于NMJ的突触后膜，以及脑和脊髓中的运动神经元上，已确定为集聚蛋白受体，作为第三个自身抗原在MG患者中出现。高浓度AChR的突触后折叠是信号从神经到肌肉高效传导的关键。MuSK是突触后膜的形成、维护和再生必不可少的分子。神经元释放的集聚蛋白结合LRP4，形成复合物，进而激活MuSK，形成LRP4-MuSK-nAChR功能单元，这表明LRP4是维持NMJ的结构和功能完整性是必需的[15]。SNX17的FERM-Like基元与LRP1胞内区NPxY基元相结合。生物信息学分析结果显示，LRP1与LRP4同属于LDLR家族成员[16]，具有相同的NPxY基元，因此，SNX17与LRP4具有相互结合的结构基础。

为了明确SNX17与LRP4之间是否能够相互作用，作者构建了原核表达载体pET30a-LRP4胞内区和真核表达载体pEASY-Blunt M2-SNX17，分别表达His-LRP4胞内区和Myc-SNX17，通过抗Myc单克隆抗体磁珠与抗His单克隆抗体磁珠进行双向的Co-IP鉴定，初步结果显示LRP4胞内区与SNX17能够发生相互作用，提示SNX17可能通过与LRP4结合，诱导LRP4肌细胞内的循环再利用，募集nAChR，修复受损的NMJ。但是，SNX17是否结合于LRP4胞内区NPxY基元仍需进一步研究。

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(2016-10-18收稿 责任编辑赵秋民)

Expression of LRP4 intracellular region and its interaction with SNX17 in muscle cells from patients with myasthenia gravis

ANYing1),LYUJie2),ZHANGYingna2),GAOFeng2),ZHANGJing2),FANGHua2)，LIQianru3)，DUYing3)，ZHANGQingyong4),WANGJinlan1),ZHANGYunke5)

1)DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofNeuroimmunology,InstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofImmunology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 4)DepartmentofThoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 5)DepartmentofRehabilitation，InstituteofRehabilitationMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000

low density lipoprotein receptor-related protein 4；sorting nexin 17；myasthenia gravis；co-immunoprecipitation

Aim: To explore the interaction between LRP4 and SNX17 at the neuromuscular junction(NMJ) in patients with myasthenia gravis(MG).Methods: We constructed prokaryotic expression vector pET30a-LRP4 intracellular region,transformed it intoE.coliBL21(DE3) bacteria and induced expression of His-LRP4 intracellular region with relative molecular weight of about 17 800; we constructed eukaryotic expression vector pEASY-Blunt M2-SNX17, transfected it into HEK293T cells and expressed Myc-SNX17 with relative molecular weight of about 53 000.Then we used two-way co-immunoprecipitation to verify whether there was interaction between LRP4 and SNX17.Results: We constructed prokaryotic expression vector pET30a-LRP4 intracellular region and eukaryotic expression vector pEASY-Blunt M2-SNX17 successfully; Anti-Myc-tag mAb-magnetic beads mixed with His-LRP4 did not occur co-precipitation, while those mixed with Myc-SNX17 showed co-precipitation; Anti-His-tag mAb-magnetic beads mixed with Myc-SNX17 did not occur co-precipitation, while those mixed with His-LRP4 intracellular region showed co-precipitation. Conclusion: Prokaryotic expression LRP4 intracellular region and eukaryotic expression SNX17 can combine directlyinvitro.

*国家自然科学基金资助项目 81471545；河南省高等学校重点科研项目计划 16A320010,17A320046；河南省科技攻关计划项目 172102

3010298；河南省高校科技创新团队项目 16IRTSTHN022

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.006

R746.1