高原鼢鼠组织中透明质酸提取工艺及分子表征

魏琳娜 汪洋 魏登邦， 魏莲 王宁 索有瑞

（1. 青海大学农牧学院，西宁 810016；2. 青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016）

高原鼢鼠组织中透明质酸提取工艺及分子表征

魏琳娜1汪洋1魏登邦1，2魏莲1王宁1索有瑞2

（1. 青海大学农牧学院，西宁 810016；2. 青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016）

旨在建立高原鼢鼠组织中透明质酸（Hyaluronic acid，HA）提取工艺。采用单因素试验确定粗提、酶解和除杂等工艺的最佳条件，通过响应面法进一步优化粗提和酶解工艺条件。通过红外分光光度法确定HA的分子结构，Bitter-Muir法确定其葡萄糖醛酸的含量，黏度法和体积排阻色谱法确定透明质酸的分子量。高原鼢鼠最佳粗取工艺∶液料比4 mL/g（水/动物组织，V/ W），提取温度26℃，提取时间1.6 h；最佳酶解工艺：酶解温度37℃，pH8.7，加酶量0.7%（1∶250 胰蛋白酶/动物组织，W/W）；最佳除杂工艺为：氯苯体积20%（氯苯/HA水溶液，V/V），以3倍体积95%乙醇沉淀，以7%活性碳（活性碳/HA水溶液，W/ V）除杂，透析时间3 h。在此工艺条件下，每500 g 高原鼢鼠组织可得到（144±3.61）mg HA粉末。平均回收率为72.73%。红外图谱显示提取物具有与Sigma公司的HA标准品一致的吸收峰，葡萄糖醛酸的质量分数为45.60%，蛋白质含量为0.11%，其分子量达到3×106Da。本工艺提取的高原鼢鼠组织来源的HA回收率好，纯度高；高原鼢鼠组织中HA分子量大，含量高。

高原鼢鼠；透明质酸（HA）；提取工艺；表征方法

透明质酸（hyaluronic acid，HA），又名玻璃酸，是一种线性大分子酸性黏多糖，由（1-β-4）-D-2葡萄糖醛酸（1-β-3）-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖的双糖单位重复连接组成［1］。HA广泛存在于动物和人体结缔组织细胞间质中，在牛眼玻璃体、皮肤、脐带、软骨和关节滑液中含量较高。对不同组织来源的HA进行的结构测定表明，其结构均一致，没有种属差异，只存在相对分子量的不同，双糖单位可达25 000之多，在体内透明质酸的分子量5-20 000 kD［2，3］。1934年Meyer和Palmer［4］首先自牛眼玻璃体内提取分离得到该物质，此后对HA的分布、化学结构理化性质、生理作用、制备工艺及其应用方面进行了深入的研究［5］。目前，HA已被广泛应用于临床医学和高级化妆品生产等领域。在机体内HA是一种多功能基质，显示出多种重要的生理功能，例如，调节蛋白质，协助水电解质的扩散及运转，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等［6-9］。尤为重要的是，HA具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子［6，7］。透明质酸溶于水、不溶于有机溶剂，具有许多天然粘多糖共有的性质。从生物体提取的HA呈白色，无异味、具有较强的吸湿性。HA在氯化钠溶液中由于葡萄糖醛酸中的羧基基团解离，产生H+使得呈现为酸性多聚阴离子状态，赋予了HA酸性黏多糖的性质［10］。研究表明，HA吸附的水分约为其本身重量的1 000倍，这是其它多糖类化合物无法比拟的。

高原鼢鼠（Myospalax baileyi）属啮齿目，仓鼠科，鼢鼠属，是青藏高原特有的地下鼠，终生生活在封闭的地下洞道中，其地下洞道生境的显著特征是低氧、高二氧化碳和高湿度，洞道内含氧量比同地区大气中低20%，而CO2含量平均高于同地区大气中CO2含量7.3-48.6倍［16］。大量的研究表明高原鼢鼠对低氧高二氧化碳环境有较强的适应性［17-26］，其骨骼已成为虎骨的替代品，目前已用于治疗骨性关节炎和风湿性关节炎的药物中。裸鼢鼠（Heterocephalus glaber）也是一种地下鼠，主要分布在非洲中东部。最近，国外对裸鼢鼠的研究结果表明，裸鼢鼠皮肤、心脏、肝脏、肺、肌肉等组织中均含有高含量的 HMM-HA（high molecular masshyaluronan，HMMHA），其分子量为6-12 MDa［12］，而小鼠等其他动物细胞分泌的HA分子量范围为0.5-3 MDa。裸鼢鼠分子量的透明质酸抑制肿瘤细胞生长及扩散［12］。研究发现，除裸鼢鼠外的很多地下鼠组织都合成分泌HMM-HA［15］。本研究以地下鼠高原鼢鼠组织为原料，明确高原鼢鼠组织中HA的分子量大小及组织中的含量，旨在为开发利用高原鼢鼠资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

高原鼢鼠捕捉于青海省西宁市湟源区宗家沟（北纬36°43'，东经101°17'，海拔3 500 m）。动物用5%戊巴比妥钠麻醉处死，采集各组织样品，分子生物学实验的组织样品立即放入液氮保存，透明质酸提取的组织样品放入-20℃冰箱冷冻保存。采样过程中所涉及到处理动物的措施均按照国家《实验动物管理条例（GB14923-2010）》执行。

主要试剂：葡萄糖醛酸标准品；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒；四硼酸钠；胰蛋白酶；浓硫酸；咔唑；浓盐酸；氢氧化钠；无水乙醇；氯苯；丙酮；NaCl；EDTA-Na2；活性炭；高岭土；碳酸钠；碳酸氢钠；Na2HPO4·12H2O；NaH2PO4·2H2O；试剂配置用水均为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 HA提取工艺 高原鼢鼠处死后，去掉头颅、皮肤、胃肠、膀胱，剩余部分洗净绞碎后整体绞碎成肉糜状，即为原料。其工艺过程为：HA粗提→蛋白质酶解→除脂→除多肽→除核酸→透析精制→冷冻干燥。

1.2.1.1 粗提工艺的优化 取5份高原鼢鼠组织，每份80 g，加入适量蒸馏水及0.5 g EDTA-Na2、3 g NaCl，在组织捣碎机内以10 000 r/min捣5-10 min后，6 000 r/min离心10 min，收集上清液。向上清液中补加1.6 g NaCl。取上述提取液加入3倍体积的φ（C2H5OH）= 95%的乙醇，静置至沉淀析出，于6 000 r/min 离心15 min，沉淀为HA粗提物。

以HA粗提物为原料，选取提取液料比（2.5、3、3.5、4、4.5 mL/g），提取温度（15、20、25、30、35℃），静置时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h），提取次数（1、2、3、4、5次）作为参考因素考察HA粗提工艺的单因素分析。在单因素试验的基础上，筛选主要影响的单因素，应用Design-Expert 8.0 软件设计响应面试验，利用响应面试验结果，反映多个因素之间相互作用的影响，确定高原鼢鼠组织中HA粗提工艺的提取条件。试验因素与水平见表1。

表1 HA粗提工艺的响应面试验因素与水平表

1.2.1.2 酶解工艺的优化 配制c（NaHCO3）= 0.05 mol/L，c（Na2CO3）= 0.05 mol/L，V（NaHCO3）∶V（Na2CO3）= 45∶5，pH 8.7。将粗提工艺得到的提取物按照相当于原动物组织量（g）：碱性缓冲液（mL）=1∶1的比例加入上述缓冲液，溶解粗提物后按120 r/min 搅拌速度进行酶解。

以HA粗提物为原料，选取酶解温度（31、33、35、37、39℃）、酶解pH值（8.3、8.5、8.7、8.9、9.1）、酶解时间（5、10、15、20、25 h）、加酶量（1∶250）（加酶量：原动物组织量=0.4、0.5、0.6、0.7、0.8%）作为参考因素考察HA酶解的单因素分析。在单因素试验的基础上，筛选主要影响的单因素，确定高原鼢鼠组织中HA粗提工艺的最佳提取条件。试验因素与水平见表2。

表2 蛋白质酶解工艺的响应面试验因素与水平表

1.2.1.3 除杂工艺的优化

（1）除脂及非水溶性杂质：向酶解液中加入酶解液体积10%、20%、30%、40%、50% 的氯苯，考察加入不同氯苯加入量对HA得率的影响，以800-1 000 r/min搅拌30 min，再于6 000 r/min离心20 min，抽取上清液。上清液中加入氯化钠至终浓度为0.2 mol/L，搅拌溶解后加3倍体积的φ（C2H5OH）= 95%的乙醇，搅拌，静置1 h，于6 000 r/min离心10 min，倾弃上清液，取固形物即得1次初级HA。

（2）除多肽：向1次初级沉淀中加入相当于原动物组织量（g）／配比缓冲液（mL）=1∶3的［ρ（NaCl）=11.6 g/L，ρ（Na2HPO4·12H2O）= 0.55 g/L，ρ（NaH2PO4·2H2O）= 0.06 g/L，V（NaCl）∶V（Na2HPO4·12H2O）∶V（NaH2PO4·2H2O）=1∶1∶1］3种含盐缓冲水溶液，搅拌至充分溶解，得HA水溶液。考察HA水溶液中加入不同体积倍数（1、2、3、4、5）的φ（C2H5OH）= 95%的乙醇对HA得率的影响，搅拌，静置1 h，于6 000 r/min离心10 min，倾弃上清液，取固形物得到除多肽后的2次初级HA。

（3）除核酸及小分子多肽：向2次初级沉淀中HA水溶液中加入高原鼢鼠组织（g）：配比缓冲液（mL）=2∶1的缓冲溶液［ρ（NaCl）=11.6 g/L，ρ（Na2HPO4·12H2O）=0.55 g/L，ρ（NaH2PO4·2H2O）=0.06 g/L，V（NaCl）∶V（Na2HPO4·12H2O）∶V（NaH2PO4·2H2O）=1∶1∶1］，得HA水溶液。考察在此溶液中加入不同质量的经稀酸稀碱处理并水洗至中性的活性碳（活性碳量／相当于原动物组织量=6%、7%、8%、9%、10%）的活性炭和活性碳2倍质量数的经稀碱溶液处理并水洗至中性的高岭土，以60-80 r/min 搅拌30 min，然后于6 000 r/min离心20 min，上清液经0.22 μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的初级HA水溶液。

（4）透析精制工艺：将初级HA 水溶液移入50 kD的透析袋中，于1 000 mL去离子水中透析，考察不同透析时间（1、2、3、4、5 h）对HA水溶液中蛋白含量的影响。抽取袋内保留液即为透析后精制的HA 水溶液。

1.2.1.4 放大实验 分别取高原鼢鼠绞碎组织3份各500 g，采用优化后的工艺流程，考察此工艺流程下高原鼢鼠组织中HA的提取率。

1.2.1.5 数据分析 所有数据采用3次实验平均测量值。所有工艺均按照Bitter-Muir咔唑法测定葡萄糖醛酸的含量［29］，根据各步骤提取物中的葡萄糖醛酸的含量并计算HA提取量［28，29］。透明质酸提取率=HA提取量/高原鼢鼠组织湿重，单位mg/g。蛋白含量按照考马斯亮蓝法（Bradford）［30］检测（南京建成生物工程有限公司），单位g/L。响应曲面模型的回归方程式和显著性统计通过Statistic 7.0软件进行计算和分析处理，系数的显著性通过t检验和P值进行分析。

1.2.2 透明质酸的鉴定 采用Thermo Nicolet iS50（USA）型傅立叶变换红外光谱仪［27］和Shimadzu UV-2550（Japan）紫外分光光度仪检测［31］的方法分别测定HA红外光谱和紫外光谱吸收特征。

1.2.3 透明质酸的分子量表征

1.2.3.1 黏度法测定HA分子量 根据文献［32］方法进行测定。

1.2.3.2 SEC-MALLS法测定HA分子量 色谱柱：Shodex SB-806M HQ：13 μm particle size，15 000Å pore size和 Shodex SB-807 HQ：35 μm particle size，30 000Å pore size（Showa Denko，Japan）串联使用。流动相：0.1 mol/L 的氯化钠溶液，0.22 μm 滤膜过滤，待用；流速0.6 mL/min；柱温25℃；进样量500 μL。检测器：Waters 2410示差折光检测器、DAWN EOS型多角度激光光散射仪（激光波长为690 nm，25℃条件下进行）串联在线检测。折光指数增量dn/dc设为0.15。

用于溶解透明质酸样品的溶剂采用0.1 mol/L NaCl溶液，经0.22 μm 滤膜过滤后备用。取透明质酸样品加入溶剂配制成0.1 mg/mL 的HA-NaCl溶液，置于混合器上混合放置24 h，直至样品完全溶解。所有待测样品均用 0.45 μm 的滤头进行过滤后进样检测，待进行温度平衡10 min 后即可进行实验。系统控制和实验数据采集软件为ASTRA V 4.90.08。

1.2.4 HA纯度测定

1.2.4.1 葡萄糖醛酸含量的测定 参照Bitter-Muir咔唑法［28］。以葡萄糖醛酸为标准品，建立计算葡萄糖醛酸含量的回归方程。计算公式为：HA（%）= 2.159 4×y（HA）×100%，式中：2.159 4为葡萄糖醛酸相对HA的质量换算系数；y（HA）为每毫升HA水溶液试样中葡萄糖醛酸的质量分数。

1.2.4.2 蛋白质含量的测定 蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。平行测定3份样品，计算平均值，通过HA水溶液中蛋白浓度与HA浓度的比值计算HA中的蛋白含量。

2 结果

2.1 粗提工艺

2.1.1 粗提工艺的单因素分析 结果如图1所示，当其它条件不变时，温度选择25℃，液料比选择4 mL/g，静置时间选择1.5 h，提取次数为3 次时，粗提物中HA含量最高。

2.1.2 响应面法优化HA粗提工艺

2.1.2.1 粗提工艺响应面分析 通过上述的单因素分析，筛选了提取温度、液料比、静置时间三个主要因素，采用Box-Behnken设计结合相应面法，以HA提取率为相应值，对HA粗提工艺进行优化，试验结果如下（表3，表4）。

采 用 Design-Expert 8.0 软 件 对 各 因 素进行回归拟合得回归方程，HA提取得率=0.34+0.0077A+0.011B+0.010C+0.0059AB-0.0047AC+0.0073BC-0.062A2-0.030B2-0.046C2。

表4中的回归方差分析的结果表明，A，B，C，A2，B2，C2（P＜0.01）为极显著项；AB，BC（P＜0.05）为显著项；AC项不显著。R2=0.990 0，r=0.995 0表明该二次回归方程得到的HA提取率模型与实际拟合较好，符合度为99.50%，说明该使用方程模拟实际是可行的。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对HA取得率的影响顺序为液料比（B）＞静置时间（C）＞提取温度（A）。

2.1.2.2 HA粗提工艺条件的确定 通过软件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最优提取工艺条件：液料比4.03 mL/g，温度26.04℃，提取时间1.56 h。在此工艺下高原鼢鼠组织中HA含量为0.338 mg/g。

2.1.2.3 粗提工艺验证 综合考虑时间，成本等因素，对工艺参数进行了一定的修正，确定适宜的提取工艺条件为：液料比4 mL/g，提取温度26℃，提取时间为1.6 h。在此条件下，进行了3次平行的重复实验，结果显示粗提工艺的平均含量为（0.335±0.018）mg/g。按照Bitter-Muir咔唑法计算得到高原鼢鼠整体组织中HA的实际含量为0.396 mg/g，平均回收率为84.60%。

2.2 蛋白酶解工艺

2.2.1 蛋白酶解工艺的单因素分析 当其它条件不变，在酶解温度选择37℃，pH值为8.7，加酶量选择0.7%，酶解时间选择20 h 时，酶解产物HA含量最高（图2）。

图1 不同提取条件对粗提物中HA含量的影响

表3 粗提工艺的分析方案与结果

2.2.2 响应面法优化HA酶解工艺条件

2.2.2.1 酶解工艺响应面分析 通过上述的单因素分析，筛选了酶解温度、酶解pH值、加酶量3个主要因素，采用Box-Behnken设计结合响应面法，以HA提取率为响应值，对HA粗提工艺进行优化，实验结果如下（表5，表6）。

采 用Design-Expert 8.0 软 件 对 各 因 素 进行回归拟合得回归方程，酶解工艺下HA提取 得 率 =0.33-0.0039A+0.0073B+0.0038C-0.0077AB+0.015AC-0.0079BC-0.034A2-0.030B2-0.021C2。

表6中的回归方差分析的结果表明，B、AB、BC、AC、A2、B2、C2（P＜0.01）为极显著项；A、C（P＜0.05）为显著项。R2=0.980 5，r=0.990 2表明该二次回归方程得到的HA提取得率模型与实际拟合较好，符合度为99.02% 说明该使用方程模拟实际是可行的。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对HA提取率的影响顺序为pH值（B）＞加酶量（A）＞酶解温度（C）。

2.2.2.2 HA酶解工艺条件的确定 通过软件Design-Expert 8.0求解方程，得出最优酶解工艺条件为酶解温度36.88℃，pH值8.72，加酶量为0.7%。在此工艺下高原鼢鼠组织中HA含量为0.326 mg/g。

表4 粗提工艺的方差分析结果

图2 不同酶解条件对提取物中HA含量的影响

2.2.2.3 酶解工艺验证 综合考虑时间，成本等因素，对工艺参数进行了一定的修正，确定适宜的酶解工艺条件为：酶解温度37℃，pH值8.7，加酶量为0.7%。在此条件下，进行了3次平行的重复实验，结果显示粗提工艺的平均含量为（0.318±0.015）mg/g。平均回收率为80.30%。

表5 酶解工艺的分析方案与结果

表6 酶解工艺的方差分析结果

2.3 纯化工艺

2.3.1 除脂 当氯苯的加入量分别为酶解液体积的10%-20% 时，透明质酸的提取率逐渐增加，到20%时达到峰值，之后随着氯苯量的增加出现先少量下降，后保持不变的状态（图3）。说明当氯苯加入量达到20% 时，能将HA水溶液中的脂类和非极性物质完全去除。为节约成本，减少工业污染，氯苯加入的体积数为酶解液的20% 为最佳。

2.3.2 除多肽 当加入2-4倍HA水溶液体积数的95% 乙醇除多肽时，表现为加入2-3 倍95% 乙醇醇沉时，HA提取率缓慢上升，蛋白含量显著下降；加入3 倍95% 乙醇时，HA含量达到峰值，蛋白含量达到最小值（图4）。3 倍体积数的95% 乙醇醇沉能达到最大的HA提取率和最小的蛋白含量。因此，为保证产品质量，提高产品得率，除多肽时选择3倍乙醇量为最佳。

2.3.3 除核酸 当加入6%-8% 活性碳除核酸时，HA的提取率保持不变，在此活性炭加入量下HA不会被活性碳吸附；当活性炭加入量超过8% 时，HA提取率逐渐下降（图5），说明在此加入量下活性碳已将HA吸附，造成一定的HA损失。为提高产品质量，减少损失，活性碳的加入量以7% 为宜。

2.3.4 透析 当透析时间在1-3 h 时，HA水溶液中的蛋白浓度显著下降，直至3 h 后保持稳定不变（图6），说明3 h 的透析时间已将绝大部分蛋白质去除。为节约时间，减少能耗，透析时间选择3 h为宜。

综合以上工艺，每500 g 高原鼢鼠组织分别得到148 mg，143 mg和141 mg 透明质酸粉末。平均回收率为72.73%。

图3 氯苯加入量对HA得率的影响

图4 醇沉倍数对HA含量及蛋白含量的影响

图5 活性碳加入量对初提水溶液中HA含量的影响

图6 透析时间对HA精制水溶液中蛋白含量的影响

2.4 HA的鉴定与分子量表征

2.4.1 高原鼢鼠组织提取的HA主要质量指标 提取的透明质酸外观为乳白色的粉末；经Bitter-Muir咔唑法法检测，葡萄糖醛酸的质量分数为45.60%，经换算HA浓度为98.47%；其蛋白质含量为0.11%，经黏度法和体积排阻法检测，其平均分子量达到3×106Da，属高分子量透明质酸。

2.4.2 紫外光谱检测 利用紫外分光光度计对高原鼢鼠组织中提取并纯化的HA在190-400 nm波长内扫描，结果（图7）显示在波长196 nm左右处出现多糖特征吸收峰，在260 nm和280 nm 未见有核酸和蛋白质的特征吸收峰，说明纯化得到的透明质酸基本不含蛋白质、核酸类杂质。

图7 高原鼢鼠组织中提取的HA紫外光谱

2.4.3 红外光谱检测 将本实验提取和纯化的高原鼢鼠组织中的HA进行红外吸收光谱分析（图8），HA的红外吸收图谱在3 400 cm-1附近有强烈的-OH伸缩振动的特征吸收峰，表明存在着多糖羟基结构。1 654 cm-1及1 560 cm-1处有-C=O和-C-N伸缩振动及N-H弯曲振动的特征吸收峰，表明存在着乙酰氨基结构。1 412 cm-1和1 384 cm-1有O=C-O-伸缩振动-OH弯曲振动偶合产生的两个吸收峰，表明存在着糖醛酸上的解离羧基和多羟基结构。以上吸收情况与美国Sigma公司的HA标准品的红外图谱（图9）一致［33］，两者在特征区与指纹区的各主要吸收峰的波长和各吸收峰间的相互强度关系相同。红外光谱结果证明提取物为透明质酸。

图8 高原鼢鼠组织中提取的HA红外光谱

图9 HA标准品红外图谱

2.4.4 黏度法表征分子量 结果根据公式η=3.6×10-4Mr0.78，黏度法计算结果（图10）显示，高原鼢鼠HA的分子量为3.05×106。

图10 黏度法表征HA分子量结果

2.4.5 体积排阻色谱法（SEC-MALL）表征分子量 结果经体积排阻色谱（SEC-MALL）鉴定（图11），高原鼢鼠各组织HA分子量分布于2.671×106-3.015×106Da之间。

3 讨论

文献研究表明，分离纯化HA的方法有：季铵盐法［34］、芳香树脂和活性炭法［35］、电-膜分离法［36］、离子交换层析法［37］等。然而，从动物组织中分离纯化HA，纯化中使用季铵盐，不但操作过程复杂，而且HA损失大；芳香树脂和活性炭法的HA损失较大；电-膜分离方法纯化程度有限；离子交换法操作不稳定，不易实现工业化。本工艺HA提取物中的蛋白质被胰蛋白酶分解后，用活性炭能有效去除剩余的大量蛋白质和全部核酸，HA的回收率高、纯度高、分子量大。本文的方法过程简捷、条件易于控制、设备比较简单，易于放大。

目前，医用和用于化妆品的透明质酸主要通过微生物发酵法提取分离，特点是产品不受原料资源限制、工艺简单并且成本低，但是微生物发酵法提取的透明质酸分子量较小［38］。生物天然材料提取透明质酸主要用提取法从牛眼、猪眼、鸡冠、人脐带天然材料等组织中提取，其透明质酸的分子量分别为7.9× 104Da、1.8×105Da、4.7×105Da、1.8×105Da［40］。本研究提取得到的透明质酸分子量为3.05×106Da，较微生物发酵法和其他天然材料组织中的分子量大，属高分子量透明质酸。有研究表明透明质酸分子量越大，保水能力越强［41］。因此，从高原鼢鼠组织中提取透明质酸可作为高级保水化妆品的天然原料。另外，透明质酸具有润滑关节，促进伤口愈合等功能。因此，从高原鼢鼠组织中提取高分子量透明质酸在临床上可用于关节炎防治和手术中伤口的愈合。

4 结论

以HA含量为指标，采用粗提、酶解和除杂等工艺提取高原鼢鼠组织透明质酸。采用单因素试验确立各水平最佳条件，通过响应面法进一步优化粗提工艺和酶解工艺。高原鼢鼠最佳粗取工艺为：液料比4 mL/g（水/动物组织，V/W），提取温度26℃，提取时间1.6 h；最佳酶解工艺：酶解温度37℃，pH值8.7，加酶量（1∶250 胰蛋白酶/动物组织，W/W）0.7%；最佳除杂工艺：氯苯体积（氯苯/ HA水溶液，V/V）20%，以3 倍体积95%乙醇沉淀，以7%活性碳（活性碳/HA水溶液，W/V）除杂，透析时间3 h。在此工艺下，每500 g 高原鼢鼠组织可得到（144±3.61）mg HA粉末，平均回收率为72.73%。

图11 高原鼢鼠组织中HA的SEC-MALL图

高原鼢鼠组织中提取的HA外观为乳白色的粉末。经Bitter-Muir法测定，葡萄糖醛酸的质量分数为45.60%，经换算HA浓度为98.47%；其蛋白质含量为0.11%，符合瑞典Healon产品质量要求（＜0.5%），达到了化妆品及食品级标准。经黏度法和体积排阻法检测，其平均分子量达到3×106Da，属高分子量HA。

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（责任编辑 李楠）

The Extraction Process and Molecular Characterization of Hyaluronic Acid in the Plateau Zokor Tissues

WEI Lin-na1WANG Yang1WEI Deng-bang1，2WEI Lian1WANG Ning1SUO You-rui2
（1. College of Agriculture and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining 810016；2. State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture，Qinghai University，Xining 810016）

We aim to establish an extraction process of hyaluronic acid（HA）from the tissues of plateau zokor（Myospalax baileyi）. One-factor experiments were used to determine the optimal conditions of crude extraction，enzymolysis，and edulcoration process，and response surface method was applied to further optimize the crude extraction and enzymolysis process. The molecular structure of the extracted HA was determined by infrared spectrophotometry，the content of glucuronic acid by the Bitter-Muir method，and the molecular weight by the method of viscosity and size exclusion chromatography. As results，the optimal conditions of crude extraction was: liquid/material ratio 4 mL/g（water/tissues，V/W），extraction temperature 26℃，and extraction time 1.6 h. The optimal enzymolysis process was: temperature 37℃，pH 8.7，and 0.7% added enzyme（1:250 trypsasy/tissue，W/W）. The optimal edulcoration process was: 20% chlorobenzene（chlorobenzene/ HA solution，V/V），95% alcohol precipitation ratio in 3 times volume，7% activated carbon（activated carbon/HA solution，W/V）to do edulcoration，and dialysis for 3 h. Under above optimal conditions，144 ± 3.61 mg HA powder was obtained from 500 g tissues of plateau zokor，and the average recovery rate was 72.73%. Infrared spectrum displayed the same absorption peak of HA by standard samples from Sigma. The mass fraction of glucuronic acid was 45.60%，and the protein content was 0.11%. The molecular weight of hyaluronic acid reached 3×106 Da. Conclusively，the HA from plateau zokor’s tissues by this extraction method is of good recovery rate and high purity，and HA in the tissues of plateau zokor is of high molecular weight and high content.

plateau zokor；hyaluronic acid；extraction process；characterization methods

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.022

2016-07-10

国家自然科学基金项目（31260512），青海省自然科学基金项目（2014-ZJ-714）

魏琳娜，女，硕士研究生，研究方向：野生动植物资源保护与利用；E-mail：weilinna92@163.com

魏莲，女，副教授，研究方向：动物生理生化；E-mail：weidengbang@163.com