液—质联用法同时检测植物源性食品中4种鼠药残留

陈 华CHEN Hua 徐文泱 - 王云昊 - 邹 桥 李 涛

(1. 湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410017; 2. 湖南农业大学资源环境学院，湖南 长沙 410012)

近年来，因鼠药造成的误食、投毒、自杀事件屡有发生，使用鼠药非法盗猎以牟取利益的事件也时有报道。随着此类案件的不断出现，为公安等执法部门提供相关的检验技术支撑已成为顺畅“行刑衔接”、维护食药安全的强烈需求。类似食品安全事故存在突发性、隐匿性等特点，实现及时有效处置此类食品安全事故面临较大挑战。由于鼠药种类繁多，而且目前尚未有任何成熟的检测方法对食品中的鼠药进行分析，中国政府也未发布食品中鼠药残留的检测方法标准，检测存在盲区和死角，因此有必要研发针对此类食品危害的检测技术，为及时有效地预防、预警、应对和处置此类事故提供必要的技术支持。

现在使用的鼠药一般分为两种，即具有4-羟基香豆素结构和茚满二酮类结构的化合物[1]。茚满二酮的代表有敌鼠钠、杀鼠酮和氯鼠酮；4-羟基香豆素有杀鼠灵、克鼠灵、氯杀鼠灵、杀鼠醚、鼠得克、溴鼠灵、噻鼠酮、氟鼠灵和溴敌隆等。这种鼠药的特点是毒性小，效果较好，人类误食后服用维生素K1能达到解毒效果[2]。此类鼠药的已有检测方法有分光光度法[3]、气相色谱及气相色谱质谱联用法[4-7]、液相色谱及液相色谱质谱联用法[8-11]。其中Hernández A M等[12]采用 LC-DAD-FLD-MS法对动物组织中的氯鼠酮、溴敌隆、溴鼠灵、鼠得克进行了检测，前处理样品用甲醇提取，方法简单，回收率可达到82%～103%。Zhu等[13]采用液液试剂法分别提取毛发中的溴敌隆和溴鼠灵，以乙酸铵和甲醇作为流动相，回收率可达90.3%～109.3%，但检出限较高，分别为0.010，0.025 mg/kg。食品中鼠药的检测方法研究并不多，麦沛明等[14]采用分散液液微试剂提取了大米中的溴鼠灵和溴敌隆，GC-MS上机，检出限达0.2 μg/kg。这种方法的特点是在样品中加入既能和水相样品相溶又能和萃取剂相溶的试剂，将萃取剂快速注入水相样品溶液，在分散剂-水相间形成纳米级微珠，每一个微珠都可看成萃取器，使得接触面积无限大，提高了萃取效率和富集倍数，常用于粮谷类样品中农药残留的检测。在调味品方面，朱峰等[15]建立了酱油、醋中杀鼠灵、杀鼠醚、敌鼠、氯敌鼠、溴敌隆、大隆、杀他丈、鼠得克、克灭鼠、氯杀鼠灵10种鼠药残留的检测方法，经由 UPLC-MS/MS检测并探讨了电离模式对结果的影响，回收率达74.8%～112%，其中在酱油中的检出限达到了15 μg/kg，这种高检出限使得在实际检测过程中可能出现假阴性的结果而影响样品的真实判定。

本研究拟扩大食品基质范围，并建立一种操作简单、灵敏度较高的液相色谱-质谱法。由于植物源性食品和动物源性食品的基质相差较大，前者含色素、碳水化合物较多，后者常含蛋白质和脂肪，因此一般需要采用不同的前处理方法。本试验拟研究植物源食品中的鼠药残留检测，为后续的动物源食品中的鼠药残留检测提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杀鼠灵、溴敌隆、溴鼠灵、杀鼠醚：99%，德国DrEhrenstorfer公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，德国Merck公司；

乙酸铵：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

PSA：分析纯，上海迪马科技有限公司；

PSA试剂管A(50 mg PSA+50 mg GCB+150 mg MgSO4)、PSA试剂管B(50 mg PSA+50mg GCB+150 mg MgSO4+50 mg C18)、PSA试剂管C(50 mg PSA+ 200 mg Na2SO4+50 mg C18)：2 mL，美国安捷伦科技有限公司；

植物源性食品：市售。

1.2 仪器与设备

液相色谱-质谱联用仪：AB SCIEXQTRAP 4500型，美国应用生物系统公司；

离心机：Centrifuge 5804R型，德国Eppendorf公司；

分析天平：BS224s型，北京赛多利斯仪器系统有限公司；

涡混振荡仪：CM-1000型，东京理化器械株式会社。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18 column(150 mm×4.6 mm×5 mm)；流动相A：乙酸铵水溶液(20 mmol/L)，流动相B：乙腈；流速：0.2 mL/min。进样量：5 μL，梯度洗脱程序见表1。

1.3.2 质谱条件 电喷雾电离源，负离子模式。离子源温度为450 ℃，气帘气25 mL/min，辅助气40 mL/min。分别采用full-scan模式和tandem模式，在整个确认试验中，4种鼠药的特征离子和碰撞能见表2。

1.3.3 标准溶液的配制 分别准确称取4种标样(0.100 0 g)于100 mL容量瓶中，以丙酮稀释至刻度，此为母液。工作液现配现用。

1.3.4 样品前处理

(1) 粮谷类食品：将样品匀质粉碎后，准确称取1 g(精确至0.000 1 g)，以10 mL乙腈提取，涡混4 min后以不小于4 000 r/min离心5 min，取上清液上机检测。

(2) 水果与蔬菜：将粉碎后的样品准确称取1 g(精确至0.000 1 g)，以10 mL乙腈提取，涡混2 min后以不小于4 000 r/min 离心5 min，提取上清液，并重复1次，合并上清液后，过萃取小柱，并取净化液上机检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

考察了不同流动相如甲醇-水(体积比70∶30)、甲醇-乙酸铵(体积比70∶30)、乙腈-乙酸铵(体积比70∶30)对质谱谱图的影响(梯度洗脱条件见表1)。由图1可知，当流动相为乙腈和乙酸铵时的色谱图峰形较好，分离度高。故以其为本次试验的流动相。4种鼠药浓度在64～200 ng/mL时均呈现良好的线性关系，线性相关系数均>0.99。分别用提取试剂和空白基质配制相同系列的标准溶液上机分析，考察信号值的差别。结果表明，相同浓度空白基质配制溶液信号值与溶液配制标准溶液信号值有一定的差别，应用空白基质溶液配制。但在实际工作中，做到每一种基质均用基质空白溶液配制过于理想化，因此，以10倍信噪比(S/N)作为定量检出限，并再提高2～3倍，得到实际检出限见表3。由表3可知，溴敌隆和溴鼠灵这2种分子量较高的化合物检出限相应较高，但已低于文献[15]的检出限。

2.2 质谱条件的优化

表3 4种鼠药的回归方程、相关系数、线性范围及检出限

Table 3 Linear equation, correlation coefficients, linearity range and LOD of 4 kinds of rodenticide residues

选用ESI正离子模式对母离子进行全扫，结果可得负离子模式下的离子响应值更高。以一级质谱扫描对各分子离子进行确认，发现母离子加合方式为[M+H]+。对碰撞能量以及源内碎裂电压进行优化，并在最优电压下选择子离子扫描，筛选出丰度最强的离子为定量离子，次强的碎片离子为定性离子。具体参数见表2。

2.3 前处理条件的优化

粮谷类食品基质较为简单，由于流动相为乙腈，因此采用乙腈作为提取溶剂后离心上机。在淀粉制品类添加检出限附近1倍浓度、2倍浓度以及10倍浓度的鼠药残留，考察回收率及相对标准偏差后发现这种前处理可满足技术参数的要求。

对于水果和蔬菜这类有糖分和色素类的食品基质，通过简单的提取离心无法有效地净化。因此选取了内含PSA的萃取柱来进行进一步的净化。2003年美国农业部将该法用于水果蔬菜中农药多残留快速检测分析。它是固相试剂和基质固相分散技术的衍生和进一步发展，其特点是溶剂用量小，操作简便、快速[16-17]。由于水果、蔬菜类食品基质含有水分较多，在前处理过程中应注意水分的去除。先采用氯化钠脱水并促使液液分层。在净化阶段，在萃取管中加入MgSO4以确保水分的完全去除。试验选取了几种内含不同吸附剂的试剂进行优化。分别为PSA、PSA+C18、PSA+GCB、PSA+GCB+C18，一般来说，GCB常用于去除色素、甾醇类和非极性干扰物，C18是除去试样中的脂肪和酯类等杂质，PSA主要去除碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类和色素。不同配比的试剂对4种鼠药检测回收率结果见表4。由表4可知，PSA+GCB的组合平均回收率最高，净化液较为澄清，净化效果较好。

2.4 回收率和精密度

为了验证本方法的准确度和精密度，选取了3个有代表性的浓度做加标试验，进行6次平行样测试，方法的回收率和精密度见表5。由表5可知，RSD均<10%，在3个浓度下的加标回收率均满足GB/T 27404—2008 对方法确认技术参数的要求。文献[15]中的样品基质仅限于调味品和面粉，其中10种鼠药残留在面粉的回收率为72.6%～120%，本试验中4种鼠药在植物源性食品的回收率为71.4%～95.2%，回收率的相对标准偏差较小。

2.5 专属性

将不含标样的空白样品以相同净化方法处理后上机，所得的空白样品无阳性结果检出。

3 结论

本试验建立了液相色谱-质谱联用法同时测定植物源性食品中溴鼠灵、杀鼠醚、溴敌隆以及杀鼠灵4种鼠药残留的方法。粮谷类制品直接以乙腈提取后上机，水果、蔬菜以乙腈提取后用PSA+GCB小柱净化即可。该方法对植物源性食品的鼠药残留检测展开了研究，在添加量为0.002～0.050 mg/kg 的情况下，杀鼠灵在植物源性食品中的平均回收率为86%，溴敌隆在植物源性食品中的平均回收率为81%，溴鼠灵在植物源性食品中的平均回收率为83%，杀鼠醚在植物源性食品中的平均回收率为92%，相对标准偏差均<10%，已满足GB/T 27404—2008 《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F技术参数的要求。该方法适用食品范围广，基质干扰小，操作简便，从样品处理到结果分析不超过3 h，本研究仅针对植物源性食品进行了研究，可在后续研究中对动物源性食品中鼠药残留开展检测工作，进一步完善食品基质范围。

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