乳酸菌与酵母菌对牦牛酸乳品质形成的影响

喻铭佳YU Ming-jia 索化夷 - 李 键 谢 婕 赵 欣 骞 宇 丁阳平 - 张 玉

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 西南大学重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；3. 重庆第二师范学院功能性食品协同创新中心，重庆 400067；4. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

牦牛乳富含蛋白质、必需氨基酸、多不饱和脂肪酸、维生素和多种微量元素[1]。牦牛乳发酵制得的牦牛酸乳具有调节人体肠道菌群、促进肠道蠕动，调节血压、降胆固醇等保健功效[2-3]。目前，牦牛酸乳的生产以自然发酵为主，产品品质不稳定，筛选牦牛酸乳发酵菌种、开发稳定的牦牛酸乳发酵剂以实现产品质量标准化是当前需要解决的问题。

乳酸菌和酵母菌是传统发酵牦牛酸乳的优势菌种[4-5]。已有学者就酸乳中乳酸菌和酵母菌共生特性展开了一些研究。余兰等[6]在驼乳发酵中添加东方伊莎酵母菌，发现东方伊莎酵母菌能促进乳酸菌的生长，提高酸乳的活菌数；Cheirsilp等[7]在牛乳中共同培养乳酸菌与酵母菌，发现乳酸菌可将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，为酵母菌提供碳源；Mendes等[8]采用酿酒酵母和保加利亚乳杆菌共生发酵，发现酿酒酵母通过酒精发酵增加了CO2浓度并产生丙氨酸，从而促进保加利亚乳杆菌生长；吕雪峰等[9]研究发现，有酿酒酵母存在时，乳酸菌能产生更多乳酸，促进酸乳凝乳；田裕春等[10]研究发现，加入酵母菌组合发酵的酸乳硬度和黏聚性上升，酸乳风味物质的含量提高；闫彬等[11]发现混合培养明串珠菌和克勒克酵母菌有利于甲酸、乙酸等风味物质的产生。综上，酸乳中的乳酸菌和酵母菌具有一定的共生特性，但乳酸菌和酵母菌在牦牛酸乳发酵过程中发挥的作用，目前还未见报道。

本研究拟以牦牛乳粉为原料，以采集到的牦牛酸乳为发酵剂，在牦牛乳传统发酵过程中用放线菌酮和青链霉素分别抑制酵母菌和乳酸菌活性，通过对牦牛酸乳滴定酸度、乙醇含量、质构、有机酸等理化指标的测定，比较牦牛酸乳在正常发酵、抑制酵母菌发酵、抑制乳酸菌发酵3种发酵方式下的品质差异，总结出乳酸菌、酵母菌分别对传统发酵牦牛酸乳品质形成的影响，为牦牛酸乳发酵剂的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

发酵剂：采自云南香格里拉的传统发酵牦牛酸乳；

牦牛乳粉：红原三千三乳业有限公司；

青链霉素混合液(100×)：北京索莱宝生物科技有限公司；

甲醇：色谱纯，河北四友卓越科技有限公司；

其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

酸度计：PHS-3C型，成都世纪方舟科技有限公司；

高效液相色谱仪：LC-20A型，日本岛津公司；

高效液相色谱柱：Agilent XDB-C18型，安捷伦科技有限公司；

质构仪：TA-XT2i型，英国SMS公司；

气相色谱质谱联用仪：Trace DSQ型，美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 传统发酵牦牛酸乳制作工艺 以牦牛乳粉为原料，牦牛酸乳为发酵剂发酵牦牛酸乳。牦牛乳粉按120 g/L与水充分混匀，得牦牛复原乳，杀菌条件95 ℃，5 min[12]，牦牛酸乳接种量5%，前发酵条件37 ℃，10 h，后发酵条件4 ℃，24 h。

1.2.2 乳酸菌、酵母菌抑制试验 在牦牛酸乳发酵过程中，分别加入放线菌酮和青链霉素抑制酵母菌和乳酸菌的生长。分别取0.001，0.002，0.004，0.006 g放线菌酮和稀释100倍的青链霉素混合液0.1，0.3，0.5，0.7 mL溶解于100 mL原料乳中，按1.2.1发酵10 h，分别对酸乳中的酵母菌和乳酸菌计数[13-14]，分别按式(1)、(2)计算酵母菌和乳酸菌的抑制率。

(1)

(2)

式中：

I1——酵母菌抑制率，%；

I2——乳酸菌抑制率，%；

A0——正常发酵酸乳的酵母菌数，CFU/mL；

A1——添加放线菌酮酸乳的酵母菌数，CFU/mL；

A2——正常发酵酸乳的乳酸菌数，CFU/mL；

A3——添加青链霉素酸乳的乳酸菌数，CFU/mL。

1.2.3 取样方法 将3种发酵方式(正常发酵、抑制酵母菌发酵、抑制乳酸菌发酵)的牦牛酸乳按不同时间点取样进行各项指标的测定。

1.2.4 滴定酸度的测定 称取10 g酸乳于150 mL锥形瓶中，与20 mL新煮沸冷却至室温的水混匀，根据文献[15]测定滴定酸度。

1.2.5 乙醇含量测定 称取25 g酸乳至1 000 mL蒸馏烧瓶中，根据文献[16]测定乙醇含量。

1.2.6 质构特性 选用A/BE探头对酸乳进行硬度、稠度、黏聚性和黏性指数测定[17]。探头直径为35 mm压力盘，下降速度为10 mm/s，测试和提升速度为1 mm/s，测试深度为发酵酸乳总高度的70%，质构仪数据采集速率为200脉冲数/秒。

1.2.7 氨基酸态氮的测定 称取2 g酸乳于烧杯中，加入18 mL 蒸馏水，超声5 min。根据文献[18]测定氨基酸态氮含量。

1.2.8 有机酸的测定 根据文献[19]，修改如下：取5 g酸乳于50 mL容量瓶中，超纯水定容，超声5 min，摇匀，过滤，吸取滤液过0.45 μm滤膜，待测。

色谱条件：Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5-micron)；流动相为甲醇和磷酸二氢铵溶液；流速为甲醇0.03 mL/min，磷酸二氢铵溶液0.57 mL/min；检测波长220 nm；柱温35 ℃，进样量10 μL。

1.2.9 维生素B1含量的测定 参照文献[20]。

1.2.10 维生素B2含量的测定 参照文献[21]。

1.2.11 挥发性风味物质的测定 取5 g酸乳样品于顶空进样瓶中，加入2 g氯化钠混匀，密封，70 ℃恒温水浴10 min，盐析45 min，参照文献[22]进行固相微萃取处理。

(1) 色谱条件：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱初温40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持6 min[23]。

(2) 质谱条件：检测器电压830 eV，溶剂延迟时间1 min；质量扫描范围m/z33～440[24]。

1.2.12 数据处理 对样品挥发性化合物的气相色谱-质谱联用图谱进行计算机和人工识谱，同时将每个峰与NIST library和Wiley library检索谱库进行匹配和比较，以相似度>800(最大值1 000)的原则作为鉴定结果。采用校正面积归一法得出各成分的峰面积。主成分分析采用SPSS 17.0软件，作图采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 酵母菌和乳酸菌的抑制率

正常发酵酸乳的酵母菌菌落数为3.2×106CFU/mL，添加0.004 g/100 mL放线菌酮酸乳的酵母菌菌落数为2.0×105CFU/mL(表1)，酵母菌抑制率为93.8%，该浓度下放线菌酮对乳酸菌无明显抑制作用；正常发酵酸乳的乳酸菌菌落数为3.0×107CFU/mL，添加0.5 mL/100 mL青链霉素酸乳的乳酸菌菌落数为2.4×106CFU/mL(表2)，乳酸菌抑制率为92%，该浓度下青链霉素对酵母菌无明显抑制作用。因此选择0.004 g/100 mL的放线菌酮抑制酵母菌，0.5 mL/100 mL的青链霉素抑制乳酸菌。

2.2 不同方式发酵过程中牦牛酸乳滴定酸度的变化

由图1可知，牦牛酸乳的滴定酸度在发酵0～10 h上升迅速，10 h后上升缓慢。这是因为前发酵期微生物生长迅速，分解乳糖产生乳酸等酸性物质，因此酸乳酸度急剧上升；过高的酸度和低温使微生物生长受到抑制，乳糖的分解随之减缓，所以发酵后期酸乳酸度趋于稳定。对比3种发酵方式酸乳酸度的变化，正常发酵和抑制酵母菌发酵的牦牛酸乳滴定酸度由23 °T增加至140 °T，而抑制乳酸菌发酵后，酸乳仅由23 °T增加至48 °T，酸度明显降低。可见乳酸菌是提高牦牛酸乳酸度的主要微生物。酸度较高是牦牛酸乳区别于普通酸乳的一个特征[25]，可能与传统发酵牦牛酸乳中含有的一些耐酸性菌(如嗜酸乳杆菌、双歧杆菌)在较低pH下仍能继续代谢产生有机酸[26]有关。

Figure 1 Titratable acidity changeof different ways of fermentation yak yogurtduring the process of fermentation

2.3 不同方式发酵过程中牦牛酸乳乙醇含量的变化

牦牛酸乳特有的醇香可能来自于酸乳发酵过程中产生的乙醇[27]。由图2可知，3种发酵方式的牦牛酸乳乙醇含量均有所上升，发酵至终点时，正常发酵、抑制乳酸菌、抑制酵母菌发酵的牦牛酸乳乙醇含量分别为3.8，2.8，1.2 g/kg，可见抑制酵母菌发酵后乙醇含量明显降低，说明牦牛酸乳中的乙醇主要来源于酵母菌发酵。抑制乳酸菌发酵后乙醇含量略低于正常发酵，可能是乳酸菌为酵母菌乙醇发酵提供碳源，从而促进酵母菌产生更多乙醇。

Figure 2 The alcohol content of different ways of fermentation yak yogurt during the process of fermentation

2.4 不同方式发酵过程中牦牛酸乳质构特性的变化

抑制乳酸菌发酵的酸乳在整个发酵过程中均未凝乳，因此未对其进行质构测定。由图3可知，抑制酵母菌发酵和正常发酵的酸乳在硬度、稠度、黏聚性和黏性指数上均呈相同的变化趋势，说明乳酸菌对牦牛酸乳的质构形成起主要作用。抑制乳酸菌发酵后，牦牛酸乳的pH达不到酪蛋白的等电点，凝胶结构无法形成。同时，乳酸菌分泌的胞外多糖可增加酸乳的黏稠度，强化酸乳咀嚼性和黏弹性[28-29]。从图3可以看出，抑制酵母菌后酸乳在各项质构指标上均有所下降，说明酵母菌对牦牛酸乳质构的形成也有一定的促进作用。研究[30]表明，酵母菌有氧呼吸会消耗牦牛乳中溶解的氧气，加快乳酸菌的产酸速度，增加酸乳的硬度。因此抑制酵母菌发酵后，牦牛酸乳硬度降低。

2.5 不同方式发酵过程中牦牛酸乳氨基酸态氮含量的变化

氨基酸态氮含量反映了酸乳中氨基酸和小分子肽的总体水平，用于评价酸乳的发酵程度。由图4可知，牦牛酸乳发酵过程中氨基酸态氮含量增加，抑制酵母菌发酵酸乳的氨基酸态氮含量变化与正常发酵基本一致，而抑制乳酸菌发酵后氨基酸态氮含量仅为正常发酵的30%。由此可见，乳酸菌是影响牦牛酸乳氨基酸态氮生成的主要因素。这可能与乳酸菌能产生更多蛋白酶，促进酸乳氨基酸和肽的生成有关。发酵前期，随着乳酸菌的生长氨基酸态氮含量快速增加；发酵后期，氨基酸态氮含量增长缓慢，可能是菌体的生长会消耗部分氨基酸[31]，使氨基酸态氮的生成速率降低。

Figure 4 The nitrogen amino acid changes of different ways of fermentation yak yogurt during the process of fermentation

2.6 不同方式发酵过程中牦牛酸乳有机酸的变化

有机酸是酸乳风味的重要来源。由图5可知，乳酸与滴定酸度的变化基本一致，柠檬酸含量呈先增后减的趋势，整个发酵过程中乙酸含量呈下降趋势。这是因为乳酸是酸乳的主体酸，柠檬酸和乙酸是许多风味物质的前体，在发酵后期柠檬酸和乙酸被不断转化为双乙酰、乙酸乙酯等风味物质[32]。抑制乳酸菌发酵的酸乳在整个发酵过程中几乎不产乳酸、柠檬酸，表明牦牛酸乳中乳酸和柠檬酸主要由乳酸菌合成。3种方式发酵过程中乙酸的含量都有所减少，但无明显差异。抑制酵母菌发酵的牦牛酸乳与正常发酵相比，乳酸含量略有降低，可能是酵母菌对乳酸菌产乳酸具有一定促进作用[33]。

2.7 不同方式发酵过程中牦牛酸乳维生素VB1、VB2的变化

由图6可知，正常发酵牦牛酸乳中的VB1、VB2含量都在增加，说明发酵酸乳能丰富牦牛乳中VB1和VB2的含量。抑制酵母菌后酸乳的VB1含量变化不大，而抑制乳酸菌后VB1急剧下降，说明牦牛酸乳中VB1的合成主要与乳酸菌有关。抑制乳酸菌后，酸乳VB1合成速率不仅降低，同时见光分解和菌体代谢消耗会加速VB1的损失。由图6(b)可知，3种发酵方式的酸乳VB2含量均在上升，但抑制乳酸菌、酵母菌后酸乳VB2含量均低于正常发酵酸乳，其中抑制酵母菌后酸乳的VB2含量最低，说明乳酸菌、酵母菌的代谢活动均能产生VB2，但由于酵母菌自身含有丰富的VB2[34]，抑制酵母菌后酸乳VB2含量损失更大。

2.8 不同发酵方式发酵过程中牦牛酸乳挥发性风味物质的变化

运用主成分分析法对牦牛酸乳中风味物质进行分析，可将多种风味物质转化为几个综合性指标(即主成分)。通过比较3种发酵方式下牦牛酸乳主成分含量的变化差异，可以更直观地总结出乳酸菌、酵母菌对牦牛酸乳风味的影响。根据廉桂芳等[35]的研究结果，牦牛酸乳主体风味物质可提取5个主成分，其中第一主成分为乙醛、乙醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、丁酸乙酯；第二主成分为3-羟基2-丁酮、3-甲基丁酸、己酸、2-壬酮；第三主成分为乙醛、丙酮、2-庚酮；第四主成分为乙酸；第五主成分为2,3-丁二酮。

Figure 5 The organic acids changes of different ways of fermentation yak yogurt during the process of fermentation

3种发酵方式牦牛酸乳发酵过程中主成分含量的变化见表3。抑制乳酸菌发酵的酸乳第一主成分含量变化与正常发酵基本一致，而抑制酵母菌发酵的酸乳第一主成分含量逐渐降低。在第二、三、四、五主成分含量上，抑制酵母菌的酸乳与正常发酵酸乳有相同变化趋势，而抑制乳酸菌发酵的酸乳含量逐渐降低。因此，牦牛酸乳中3-羟基2-丁酮、2，3-丁二酮、2-庚酮、2-壬酮、丙酮、3-甲基丁酸、己酸、乙酸、乙醛的合成与乳酸菌有关，其中酮类物质赋予酸乳奶香，酸类物质赋予酸乳清爽的口感。乙醛是酸乳的主要风味物质，其含量与乳酸菌和酵母菌的代谢有关，乳酸菌能利用苏氨酸产生乙醛，而酵母菌的代谢产物可能促进酸乳中乙醛含量的升高，与Gadaga等[36]的研究结果相一致。此外，牦牛酸乳中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙醇、3-甲基丁醇、2-甲基丁醇的合成与酵母菌有关，其中乙醇及其它醇类物质可能来源于酵母菌对乳糖、氨基酸和脂肪的发酵作用[37]。酸乳中乙醇与脂肪酸反应可生成乙酸乙酯等酯类[22]，使酸乳具有一定的果香。雷华威等[38]发现市售酸乳主要风味物质为酮类和酸类，不含醇类和酯类物质。因此，酵母菌发酵产生的醇、酯增加了酸乳的醇香和果香，与酸味搭配实现了牦牛酸乳独特的风味。

Figure 6 The Vitamin B changes of different ways of fermentation yak yogurt during the process of fermentation

† 样品编号1～5表示正常发酵2，6，10，22，34 h；编号6～10表示抑制酵母菌发酵2，6，10，22，34 h；编号11～15表示抑制乳酸菌发酵2，6，10，22，34 h。

3 结论

通过比较3种发酵方式牦牛酸乳品质相关指标的差异，得出乳酸菌和酵母菌发酵对牦牛酸乳的品质形成均起到关键作用。

(1) 乳酸菌在牦牛酸乳发酵过程中起主导作用。乳酸菌发酵产酸使酸乳凝乳，同时代谢产生氨基酸态氮和VB1，提高了酸乳的营养价值。乳酸菌发酵产生的有机酸和酮类物质，使酸乳呈现出典型的酸味和奶香。

(2) 酵母菌有助于牦牛酸乳独特风味的形成。酵母菌发酵主要产生醇和酯类物质，醇类赋予牦牛酸乳典型的醇香，乙酸乙酯和丁酸乙酯使牦牛酸乳呈现甜润的水果香气。此外，酵母菌的存在提高了牦牛酸乳的VB2含量。

(3) 乳酸菌和酵母菌混合发酵可提高牦牛酸乳的品质，发酵过程中，乳酸菌促进酵母菌产乙醇，酵母菌促进乳酸菌产乳酸，促进质构的形成。二者混合发酵使酸乳的风味成分更加复杂，酸乳呈现特有的感官风味。该研究的结果可为开发乳酸菌和酵母菌混合菌种发酵剂、生产高品质的牦牛酸乳提供理论依据，但牦牛酸乳发酵剂的研发及其在生产中的应用尚需进一步研究。

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