怀山药抗性淀粉理化性质及体外消化性研究

马丽苹MA Li-ping 焦昆鹏 - 罗 磊 向进乐,3 -,3 张晓宇 - 樊金玲 - 朱文学 -

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 河南省食品原料工程技术研究中心，河南 洛阳 471023; 3. 食品加工与安全国家重点实验室，河南 洛阳 471023)

怀山药是中国著名的“四大怀药”之一，也是补中益气、物美价廉的蔬菜品种，主产于河南温县、武陟等地，富含糖蛋白、山药多糖、薯蓣皂苷元、淀粉、各种游离氨基酸和黄酮等生物活性成分[1-2]。

抗性淀粉是指不被健康个体小肠吸收的膳食淀粉，与其他膳食纤维类似，到达结肠后，被用作结肠微生物的发酵底物，进而对机体健康产生各种有益的影响[3]。研究发现，抗性淀粉具有改善结肠健康[4-6]、控制糖尿病[7-8]、降低血液胆固醇水平[9-10]、减少生物结石的形成[11]和增加矿物质的吸收[12]等潜力。抗性淀粉具有挤压特性良好、糊化温度高、口感好、无异味、能增加食物的脆性和减少含油量等功能特性，因此可作为食品添加剂用于食品工业，如将其添加到饼干、面条、面包和酸奶等食品中，从而开发高品质功能性食品[13]。

据报道[14]，怀山药淀粉含量高达20%～30%，是重要的淀粉来源。虽然关于其他品种山药淀粉和抗性淀粉的研究已有报道[15-16]，但山药淀粉的组成和含量受到山药品种、生长条件和环境因素的影响，同时对由其制备的抗性淀粉也产生一定的影响。目前关于怀山药的研究大多集中在粗加工[1,17]、化学成分[18-19]和育种[20-21]等方面，而对其抗性淀粉的研究鲜见报道。因此，本研究应用压热法制备怀山药抗性淀粉，分析并阐明其基本理化性质、化学结构、热特性和体外消化性等，以期为怀山药抗性淀粉的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

怀山药：购自河南焦作市温县；

猪胰α-淀粉酶：10 units/mg，美国Sigma公司；

直链淀粉：美国Sigma公司；

耐高温α-淀粉酶：4万U/g，江苏锐阳生物科技有限公司；

糖化酶：10万U/g，江苏锐阳生物科技有限公司；

透析袋：截留分子量3 500，合肥博美生物科技有限责任公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：UV1800型，日本岛津公司；

傅里叶变换红外光谱：VERTEX70型，德国Bruck公司；

差示扫描量热仪：DSC1型，瑞士Mettler-Toledo公司；

X-射线衍射仪：D8A型，德国Bruck公司；

多管架自动平衡离心机：TDZ5-WS型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：101型，天津跃进器械厂；

电热恒温水浴锅：HH-4型，北京科伟永兴仪器有限公司；

分析天平：FA1004型，上海上平仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 怀山药原淀粉的制备 新鲜的怀山药经清洗、去皮和切片后浸泡于5%～6%的抗坏血酸溶液中15 min，匀浆后用0.2 mol/L的NaOH溶液调pH值至8.5，搅拌1 h后过60目筛，自来水反复冲洗滤渣至澄清状后，调节滤液pH值至7.0，静置2 h，取下层悬浊液于4 500 r/min离心10 min，将沉淀置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重，研碎后即可得到怀山药淀粉。制备的怀山药淀粉经双波长法测定直链淀粉含量为24.40%。

1.3.2 怀山药抗性淀粉的制备及纯化

(1) 怀山药抗性淀粉制备：配制25%淀粉悬浊液，置于高压灭菌锅中，115 ℃ 压热处理100 min，冷却到室温后，置于4 ℃冰箱老化6 h，然后80 ℃烘干，粉碎并过60目筛，即得怀山药粗抗性淀粉。按文献[22]所述方法测得抗性淀粉得率为13.41%。

(2) 酶解纯化怀山药抗性淀粉：称取一定质量怀山药粗抗性淀粉，加蒸馏水，用pH 6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节pH值到6.0～7.0，然后加入过量的耐高温α-淀粉酶，90 ℃酶解2 h，冷却至室温后，4 mol/L柠檬酸调pH值到4.0～5.0，加入过量糖化酶，60 ℃水解1 h后，4 000 r/min离心10 min，弃去上清液，然后依次用95%，85%，75%的乙醇冲洗沉淀，4 000 r/min离心10 min，弃上清，50 ℃烘干，粉碎，即可得到纯化的怀山药抗性淀粉。

1.3.3 电镜扫描 依次称量已充分干燥的淀粉样品，然后再用导电胶把样品固定在铜台上，喷金后用扫描电镜观察并拍摄。

1.3.4 热力学特性分析 将淀粉样品与水按照1∶3 (g/mL)的比例配成淀粉乳，取少量加入标准铝坩埚，称重压盖后，于4 ℃密封平衡1 d。测量同时，用空坩埚做空白参照。测量温度范围：20～130 ℃，升温速率为10 ℃/min。用Thermal analysis 软件计算得出起始温度To、峰值温度Tp、终止温度Tc和糊化焓ΔH的变化情况。

1.3.5 淀粉的碘吸收特性 称取20 mg淀粉样品，置于具塞试管中，用无水乙醇润湿样品后，再用1 mL 2 mol/L的氢氧化钾充分溶解样品，然后加入10 mL蒸馏水，调节pH值至6.0～7.0，加蒸馏水至50 mL，反复倒置混合均匀后，吸取上述溶液25 mL于100 mL容量瓶中，再加入80 mL蒸馏水和2 mL碘试剂，蒸馏水定容后立刻混合均匀，在波长450～800 nm 内进行扫描。

1.3.6 红外光谱的分析 将淀粉样品和溴化钾置于105 ℃烘干后，样品和溴化钾按1∶100的比例加入玛瑙研钵中研好后置于压片机中压片，取出样品薄片在400～4 000 cm-1波段进行红外扫描。

1.3.7 X-衍射分析 采用X-射线衍射仪测定淀粉的晶体特性。衍射条件：特征射线CuKα，加速电压40 kV，管电流30 mA，测量角度2θ为5°～70°，扫描速度4°/min。

1.3.8 淀粉的透明度和持水性

(1) 透明度：用蒸馏水将淀粉样品配成浓度为1%的淀粉乳，沸水糊化15 min，糊化过程中不断添加蒸馏水以保持淀粉乳体积不发生变化，冷却到室温后，在620 nm波长处分别测定放置0，1，3，6，12 h时淀粉糊的吸光率。用蒸馏水作为空白参比，设其透光率为100%，以淀粉糊的透光率值表示淀粉糊的透明度。

(2) 持水性：将50 mg淀粉样品分散于10 mL水中，置于45，55，65，75，85 ℃水浴1 h，冷却至室温后，6 000 r/min离心15 min，弃掉上清液，擦干离心管内、外壁所附着的水分后，称沉淀质量，按式(1)计算持水力。

(1)

式中：

WHC——持水力，%；

m1——沉淀质量，g；

m2——样品质量，g。

1.3.9 体外消化特性分析 采用In-Vitro 模型系统研究怀山药原淀粉和抗性淀粉的消化特性。

(1) 标准曲线制作：参照史苗苗等[23]的方法制备得到的标准曲线方程为：y=1.456 3x+0.062 7，R2=0.994 4。

(2) 体外消化性能测定：参照史苗苗等[23]的方法略加修改如下：称取淀粉样品200 mg，加入20 mL磷酸盐缓冲液和15 mL猪胰α-淀粉酶(260 U/mL)溶液，混匀后装入透析袋中，然后将透析袋置于盛有400 mL磷酸盐缓冲液的烧杯中，再在37 ℃恒温震荡水浴中进行消化反应，然后分别于1，2，3，4，5，6 h时取出一定量的消化渗析液，稀释一定倍数后，测定其中麦芽糖含量。按式(2)～(4)计算整个体系中消化产物量、还原糖释放量和平均消化速度。

CHO=C×D×(435-S)×0.001，

(2)

(3)

(4)

式中：

C——标准曲线得出的麦芽糖含量，mg；

D——消化液的稀释倍数；

CHO——体系中产生的水解糖的含量，mg；

435——整个体系的溶液体积，mL；

S——每次取出的消化液体积，mL；

0.001——换算系数；

V——平均消化速度，mg/(g·h)；

W1——样品的质量，g；

W0——总干物质的量，g；

H——反应时间，h。

2 结果与分析

2.1 淀粉的超微结构

由图1(a)可知，原淀粉表面光滑，颗粒完整，呈不规则且大小不一的椭球型、球形、三角形等多种形态。通过压热法制备的抗性淀粉[图1(b)]颗粒特征消失，呈现疏松的片层状结构。出现此现象可能是高温使淀粉发生糊化，导致其颗粒结构被破坏，而直链淀粉则从淀粉颗粒中溶出，待冷却时，直链淀粉会重新排列形成双螺旋结构而形成非常稳定的结晶结构，进而在耐高温α-淀粉酶和糖化酶的作用下，粗抗性淀粉中的可溶性淀粉颗粒被酶解，从而使纯化抗性淀粉呈现表面疏松的片状结构[24]。怀山药抗性淀粉表面疏松的结构可能也是其吸水能力增加的原因之一。

2.2 淀粉的热力学特性

怀山药原淀粉及其抗性淀粉的DSC图谱见图2，其对应曲线参数见表1。由表1可知，怀山药原淀粉的糊化温度为76.41～89.49 ℃，在83.33 ℃处有吸热峰，糊化焓为74.47 J/g；抗性淀粉的糊化温度高于原淀粉，为103.77～109.64 ℃，在107.21 ℃处有吸热峰，糊化焓为141.44 J/g。怀山药抗性淀粉的糊化温度高于原淀粉，与玉米、小麦和马铃薯淀粉及其抗性淀粉的热特性相似[25]，但与这些抗性淀粉相比，怀山药抗性淀粉的吸热峰温度较低，可能与其晶体结构不致密、结晶度不高有关。淀粉颗粒经压热处理制备抗性淀粉时，淀粉链重排形成更致密的结晶结构，因此在糊化时没有发生吸水膨胀，也就没有形成糊化吸热峰。抗性淀粉的晶体结构热稳定性高，因此需要更多的热量使其发生非晶化相变，故导致其相变吸热峰吸热焓增大[26]。怀山药抗性淀粉具有较高的热稳定性，可以经受大多数食品加工过程。

Figure 2 The thermodynamic characteristic curve of raw starch and resistant starch fromDioscoreaoppositeThunb. cv. Huaiqing

2.3 淀粉的碘吸收特性

直链淀粉的最大吸收峰在600～640 nm，支链淀粉的最大吸收峰在520～560 nm[27]。由图3可知，抗性淀粉-碘复合物的最大吸收峰在580 nm，位于直链淀粉与支链淀粉之间，且由直链淀粉处向支链淀粉处偏移，表明怀山药淀粉经压热处理后改变了直链淀粉构象，其络合碘分子的数目减少，颜色变浅，吸光值减小，最大吸收波长向较短波长方向移动。另外，抗性淀粉-碘复合物的吸收峰比原淀粉窄，说明怀山药抗性淀粉的分子质量分布比较集中[28]。

Figure 3 Iodine absorption curves of raw starch and its RS fromDioscoreaoppositeThunb. cv. Huaiqing

2.4 淀粉的红外光谱分析

由图4可知，原淀粉和抗性淀粉均有以下吸收峰：3 365.87 cm-1和3 433.84 cm-1处为缔合—OH的伸缩振动峰；2 933.55 cm-1和2 936.25 cm-1处为饱和—CH的伸缩振动峰；1 653.66 cm-1和1 651.80 cm-1处为醛基C═O的伸缩振动峰；1 161.93 cm-1和1 158.92 cm-1处为与伯醇羟基相连的C—O伸缩振动峰；993.79 cm-1和1 000.82 cm-1处为与仲醇羟基相连的C—O—C伸缩振动峰；861.99 cm-1和857.00 cm-1处为D-吡喃葡萄糖的吸收带峰。比较原淀粉和抗性淀粉红外图谱也可发现，怀山药淀粉在929.38 cm-1处有D-吡喃葡萄糖的非对称伸缩振动，在766.68 cm-1处有D-吡喃葡萄糖的对称性伸缩振动，而怀山药抗性淀粉在这些波段均没有吸收峰，说明原淀粉经压热处理后D-吡喃结构被破坏。总体而言，压热处理前后淀粉的化学结构相似，没有生成新的基团，说明压热法制备怀山药抗性淀粉主要发生了物理变化。

2.5 淀粉的结晶结构

根据淀粉颗粒X射线衍射图，可以将淀粉样品划分为A、B、C 3 种结晶型，其中C型普遍认为是A型与B型的混合物[15]。 由图5可知，怀山药原淀粉的X-衍射图谱分别在2θ为5.76°，11.40°左右有中强衍射峰，在2θ为15.12°，17.25°，23.03°左右有强衍射峰，证明怀山药原淀粉属于C型淀粉，与已报道的淮山药淀粉和长山药淀粉晶型一致[15,29]。而怀山药抗性淀粉仅在16.85°，22.49°有较强衍射峰，而且峰形较为弥散，表明压热处理使怀山药淀粉的分子结构被打乱后重新排列，导致结晶结构发生了改变，具体表现为部分特征峰的消失。

2.6 淀粉的透明度和持水性

淀粉糊的透明度能够反映淀粉与水互溶能力以及膨胀程度，直接影响淀粉产品的用途、外观和可接受性。淀粉糊的透明度常用透光率表示，透光率越高，则淀粉糊的透明度越好，所加工的淀粉产品亮度越高[30]。由图6(a)可知，怀山药原淀粉糊在各个时间点的透光率均比其抗性淀粉的高，与张丽芬等[29]报道的淮山药抗性淀粉结果一致。这可能是由于抗性淀粉中直链淀粉含量高，而直链淀粉分子相互缔合使光线散射增强造成的。因此，怀山药抗性淀粉比较适合应用于黏稠且透明度低的饮料中，以增加饮料的悬浮度和不透明度。

淀粉持水性表示羟基与淀粉分子链由共价结合所产生的结合水量的大小。由图6(b)可知，当水浴温度低于75 ℃时，怀山药抗性淀粉的持水性大于原淀粉的持水性，即抗性淀粉具有更大的持水能力，可能是抗性淀粉制备过程中，糊化后淀粉分子在凝沉过程中分子重排形成具有疏松的片层结构[图1(b)]，短直链淀粉分子增多，从而使葡萄糖单元外侧的亲水羟基增多，因而吸水能力增强。然而当水浴温度为85 ℃时，原淀粉的持水性明显增加，显著高于抗性淀粉的，可能是由于该温度高于怀山药淀粉的糊化温度(83.3 ℃)，原淀粉糊化时大量吸水造成的。

2.7 淀粉的体外消化性

相同时间内，消化产物量越多，表示越容易消化。由图7(a)可知，原淀粉与抗性淀粉消化产物的量均随消化时间的延长而增加。但与原淀粉相比，经相同消化时间后，抗性淀粉消化产物的量明显低于原淀粉的，可能是抗性淀粉形成了较稳定的晶格，胰淀粉酶较难与其发挥作用。表2说明随着消化时间的延长，原淀粉和抗性淀粉还原糖释放率增加，但抗性淀粉增加幅度较小，说明抗性淀粉更耐消化。

Figure 7 Digested product amount andaverage digestion rate of raw starch and resistant starch

由图7(b)可知，随着消化时间的延长原淀粉与抗性淀粉的消化速率都减小，尤其是前3 h，二者的平均消化速率下降较快，而3 h之后，消化速率呈现缓慢下降趋势。在相同消化时间时，抗性淀粉的平均消化速率均明显小于原淀粉的。试验所用的猪胰α-淀粉酶为内切酶，能够对淀粉的α-1,4糖苷键进行无规则的水解产生更多的还原糖，但是随着消化时间的延长，大的淀粉分子被水解成小的分子，与酶结合的位点减少，反应速率就减慢，产物的生成速率减慢，但整个体系的产物量是增加的[16]。猪胰α-淀粉酶在水解淀粉时，酶分子首先扩散到淀粉颗粒表面与淀粉链的特定区域结合进行分子的固定，然后催化淀粉链水解。与原淀粉相比，抗性淀粉因淀粉链经过蜷曲折叠形成了坚实的抗酶解的晶体结构，因而更耐消化[23]。

3 结论

本试验采用碱法制备怀山药淀粉，继而采用压热法制得其抗性淀粉。与原淀粉相比，怀山药抗性淀粉颗粒特征消失，表面疏松呈片层结构，在一定温度范围内持水性增加，热稳定性更高且在体外更耐消化。因此，怀山药淀粉经改性后，淀粉糊性质得到显著改善，更适用于食品加工，尤其是黏稠食品、低透明度饮料、果冻和乳制品等领域。

后期将进一步研究怀山药抗性淀粉在机体内的抗消化作用、益生作用及其机制，深入探讨其肠道保健潜力，为怀山药淀粉资源的有效利用提供理论依据。

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