基于酸水解法酿酒糯高粱与粳高粱结合态香气研究

吕佳慧范文来 徐 岩

(1. 教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡 214122)

基于酸水解法酿酒糯高粱与粳高粱结合态香气研究

吕佳慧1,2范文来 徐 岩

(1. 教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡 214122)

为探索糯高粱和粳高粱对酿酒品质的影响，采用固相萃取吸附前体物质、酸水解释放挥发性成分，应用HS—SPME结合GC—MS定性、定量高粱结合态香气成分。在两种高粱中共检测到21种结合态香气物质(其中3种为临时性鉴定的)，包括5种醇类、7种醛酮类、5种芳香族、3种萜烯及降异戊二烯类和1种呋喃类化合物。研究发现，糯和粳高粱结合态香气化合物总量分别为7 192，6 922 μg/kg，糯高粱水解后香气化合物总量比粳高粱高3.90%。含量差异较大的是醛酮类化合物，其次是萜烯及降异戊二烯类化合物。2,2,6-三甲基环己酮、TDN、异佛尔酮首次在高粱结合态香气中检测到。

糯高粱；粳高粱；结合态风味；顶空固相微萃取

结合态香气(bound aromas)是不挥发的糖苷类前体(常见的是O-β-D-糖苷或O-双糖苷)在酸解或酶解条件下释放出的具有香气的挥发性成分(见图1)。来源于原料的风味物质主要是以结合态的、不挥发性的、无气味的糖苷形式存在与积累于植物中[1]。国外已对酿酒葡萄结合态风味进行了广泛研究，形成了一整套包括检测方法[2]、风味组成[3]和风味修饰机制[4]等技术。学者[5]发现甘薯中存在结合态形式的里哪醇(linalol)、香叶醇(geraniol)、橙花醇(nerol)和松油醇(α-terpinol)，且单萜醇对甘薯烧酒的风味有一定的感官贡献。

白酒是以谷物为原料，经蒸煮、糖化、酒曲发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成的传统蒸馏酒。白酒酿造原料以高粱为主，玉米、小麦、豌豆等也可作为酿酒原料。

高粱是中国白酒生产的主要原料，酿酒常用的高粱有杂交粳高粱和糯高粱两种。中国研究人员更多关注酿酒高粱的理化特性如淀粉、脂肪和单宁等物质含量[6]以及其对白酒产量和质量的影响[7]，而原料高粱对白酒风味的影响以及高粱结合态风味的相关研究极少。早期曾经研究过杂交粳高粱与糯高粱的酿酒特性[8-11]；也对高粱蒸煮后的香气进行过初步研究[12]。前几年，研究人员[13]基于酸水解法研究了高粱、玉米、大麦、小麦、大米、糯米6种谷物原料的结合态香气，检测到35种挥发性成分，并比较了6种谷物香气的差异，但未涉及糯高粱与粳高粱的结合态香气。

为更好地了解酿酒糯高粱与粳高粱结合态香气，本研究拟采用C18固相萃取小柱吸附前体物质，酸水解释放风味物质，结合HS—SPME—GC—MS技术研究高粱的结合态香气组成，以期从结合态香气角度了解高粱对白酒风味的贡献。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

红缨子糯高粱：贵州某酒厂；

杂交粳高粱：山东某酒厂；

NaCl、盐酸、Na2HPO4、柠檬酸、NaOH：分析纯，上海国药集团；

乙醇、甲醇、表 1中鉴定出的18种化合物标准品：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱质谱联用仪：GC 6890N-MSD 5975型，美国Agilent 公司；

自动进样器：MPS2型，德国Gerstel公司；

DVB/CAR/PDMS萃取头：57329-U Supelco 50/30 μm，美国Supelco公司；

FFAP毛细管柱：60 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Supelco公司；

Supelco固相萃取装置：Visiprep DL型，美国Supelco公司；

LC-C18固相萃取小柱：2 g/10 mL，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 结合态香气前体提取和分离 根据文献[14]修改如下：2 g高粱样品用30 mL乙醇提取，37 ℃摇床过夜，转速200 r/min，过滤；30 mL甲醇相同条件再次提取；合并提取液，35 ℃旋转蒸发，用30 mL 超纯水复溶，12 000 r/min离心30 min，取上清液。固相萃取操作：10 mL色谱级甲醇活化C18柱子；10 mL超纯水平衡柱子；上清液上样；90 mL超纯水去除糖和酸；5 mL色谱级甲醇洗脱。收集洗脱液，缓慢氮吹至干。

1.2.2 结合态香气前体酸解 10 mL复溶的缓冲液用盐酸调至pH为1，100 ℃反应1 h，反应完用固体NaOH调至pH为7(在冰浴中进行)，保证溶液体积不变。

1.2.3 HS—SPME—GC—MS分析 根据文献[15]修改如下：准确吸取8 mL酸解液于顶空瓶中，加入3 g NaCl和5 μL 浓度81.90 mg/L的内标2-辛醇溶液，旋紧瓶盖，进行HS—SPME—GC—MS分析。

色谱条件：载气He，流速2 mL/min，不分流进样，进样量1 μL；色谱柱DB-FFAP(60 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，进样口温度250 ℃；升温程序：初始温度50 ℃，2 min后以4 ℃/min 升温至230 ℃，保持15 min[15]。HS-SPME条件：DVB/CAR/PDMS三相萃取头，45 ℃预热2.5 min，吸附45 min直接进样，GC解吸5 min。质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，全扫描模式。

1.2.4 酸解产物定性定量分析 定性：化合物通过NIST 05.L库的标准图谱及标准品的保留指数(RI)比对定性；没有标准品的化合物，参考文献[16]RI定性。定量：化合物稀释成一系列浓度的标准溶液，内标为2-辛醇，HS—SPME—GC—MS分析，用选择离子法(SIM)计算化合物峰面积，以化合物与内标物的峰面积比为横坐标、质量浓度比为纵坐标建立标准曲线。其中，1,3,5-三甲基苯、2,5-二甲基苯甲醛和1-十二醇为临时性鉴定、半定量，化合物的质量浓度是内标的质量浓度、化合物与内标的峰面积比的乘积。

检测限(LOD)为3倍信噪比时物质的质量浓度；定量限(LOQ)为10倍信噪比时物质的质量浓度。回收率按式(1)计算：

(1)

式中：

R——回收率，%；

Cx——在样品中添加一定浓度标准品后检测到的化合物的质量浓度，μg/L；

C0——在样品中不加入标准品时所能检测到的化合物的质量浓度，μg/L；

Cs——添加的标准品的质量浓度，μg/L。

2 结果与讨论

2.1 结合态香气物质定性和定量

参考葡萄前体物质酸水解、释放结合态香气物质的最优条件[3]，采用100 ℃，pH 1的条件水解高粱结合态香气前体物质。水解后GC—MS测定结果表明，在糯高粱和粳高粱酸水解液中共鉴定出21种化合物，包括5种醇类、7种醛酮类、5种芳香族、3种萜烯及降异戊二烯类和1种呋喃类化合物(见图 2)。

21种物质中，除了1,3,5-三甲基苯、2,5-二甲基苯甲醛和1-十二醇为临时性鉴定、半定量，其余18种物质建立标准曲线(见表 1)，R2为0.980 7～0.999 7，线性良好；回收率在85%～113%，RSD在8%以内，适于结合态香气物质的定量。

2.2 糯高粱与粳高粱结合态香气物质分析

从水解液检测结果看，醇类和醛酮类是糯高粱和粳高粱结合态香气物质中含量较丰富的化合物，醇类化合物含量占糯高粱和粳高粱结合态香气物质总量的28.75%和29.14%，醛酮类化合物占28.79%和28.16%，其次是萜烯及降异戊二烯类化合物。从单个化合物含量来看，2-乙基己醇的含量最高，其次是β-苯乙醇、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘(TDN)。

1. 已醛 2. 壬醛 3. 反式-2-壬烯醛 4. 反式-2-辛烯醛 5. 苯甲醛 6. 辛醛 7. 庚醛 8. 2,5-二甲基苯甲醛 9.β-大马酮 10. 异佛尔酮 11. 苯乙酮 12. 2,2,6-三甲基环己酮 13. TDN 14. 1,3,5-三甲基苯 15. 2-戊基呋喃 16. 2-乙基己醇 17. 1-辛醇 18. 1-辛烯-3-醇 19.β-苯乙醇 20. 正己醇 21. 1-十二醇 IS. 2-辛醇(内标)

图2 高粱酸水解后挥发性物质GC—MS总离子流图(TIC)

Figure 2 GC—MS total ion current (TIC) chromatogram of sorghums’ volatiles after acid hydrolysis

糯高粱和粳高粱结合态香气物质中检测到5种醇类化合物。其中，2-乙基己醇含量最高，糯和粳高粱中含量分别为1 147 μg/kg和1 085 μg/kg。正己醇、1-辛烯-3-醇是常见的糖苷前体水解产生的脂肪醇类物质[17]。糖苷前体酸水解的断键方式是醚键(见图1)，形成碳正离子[18]，与氢氧根结合生成醇类化合物。

醛酮类化合物种类较丰富，检测到6种醛类和1种环酮类化合物。其中，反-2-辛烯醛含量最高，糯和粳高粱中含量分别是558.9 μg/kg和527.5 μg/kg。而反-2-壬烯醛是豉香

型白酒的关键香气，糯和粳高梁含量分别是381.0 μg/kg和359.1 μg/kg。醛类化合物可能是酸水解过程中的氧化产物[17]。2,2,6-三甲基环己酮呈蔷薇花香，首次在高粱的结合态香气中检测，糯和粳高粱中含量分别是85.34 μg/kg和81.30 μg/kg。该化合物被认为是类胡萝卜素的降解产物。

芳香族类化合物分别占糯和粳高粱结合态香气总量的18.44%和18.75%。其中，β-苯乙醇含量最高，糯和粳高粱中含量分别是803.4 μg/kg和792.9 μg/kg。β-苯乙醇呈甜香、玫瑰花香和蜂蜜香，白酒中的浓度0.06～9.26 mg/L[19]133，是豉香型白酒的重要香气成分。苯甲醛广泛存在于酒类产品中，呈樱桃—杏仁蛋白软糖的气味[19]134，糯和粳高粱中含量分别是103.2 μg/kg和103.4 μg/kg。β-苯乙醇和苯甲醛是常见的结合态香气物质。

两种高粱结合态香气物质中检测到β-大马酮、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘(TDN)、异佛尔酮3种萜烯及降异戊二烯类(norisopreonids)化合物。其中，TDN含量最高，糯和粳高粱中含量分别是765.2 μg/kg和723.2 μg/kg。TDN被描述为汽油、煤油和柴油臭，是雷司令(Riesling)葡萄酒典型的老化风味，已在汾酒和郎酒检测到。此外，在高粱结合态风味中还检测到了TDN和异佛尔酮，二者来源于类胡萝卜素的降解及重排[19]284。而β-大马酮是清香型白酒的特征风味成分[19]299，糯和粳高粱中含量分别是256.7 μg/kg和264.0 μg/kg。在甘薯烧酒中，甘薯品种是决定酿造过程中β-大马酮含量的重要因素[20]。

† a表示无标准品，为半定量结果

在糯高粱和粳高粱中，结合态香气总量分别是7 192 μg/kg 和6 922 μg/kg(见表 2)，糯高粱含量比粳高粱高3.90%。含量差异较大的是醛酮类，糯高粱比粳高粱高6.21%。其次是萜烯及降异戊二烯类、醇类化合物，糯高粱高3.94%和2.53%。从单个化合物来看，糯高粱和粳高粱含量差异较大的是1-十二醇、2,5-二甲基苯甲醛，粳高粱1-十二醇含量比糯高粱高59.6%，2,5-二甲基苯甲醛高27.1%。而糯高粱的大多数化合物含量比粳高粱高，在这些化合物中含量差异较大的是1-辛烯-3-醇、苯乙酮，糯高粱中1-辛烯-3-醇含量比粳高粱高7.86%，苯乙酮高7.43%。此外，糯和粳高粱水解反应后的溶液颜色也存在一定的差异，分别呈枣红色和黄色，可能是高粱多酚及水解产物不同而引起的。

3 结论

本研究采用HS—SPME—GC—MS定量了21种化合物。醇类和醛酮类是两种高粱结合态香气中含量较丰富的化合物，其次是萜烯及降异戊二烯类化合物。其中，醛酮类化合物种类较丰富，还检测到了2,2,6-三甲基环己酮、TDN、异佛尔酮。

在糯和粳高粱的醇提酸解挥发性成分中，结合态香气总量分别是7 192 μg/kg和6 922 μg/kg，含量差异较大的是醛酮类化合物，其次是萜烯及降异戊二烯类、醇类化合物。单个化合物来看，糯和粳高粱含量差异较大的是1-十二醇、2,5-二甲基苯甲醛。本研究探讨了酸性环境下糯高粱和粳高粱的结合态香气的差异，为原料对白酒的风味贡献研究提供了新的思路。原料结合态香气的来源包括糖苷和类胡萝卜素，因此笔者后续将对高粱的结合态香气产生途径和来源进行探究，进一步了解酿造原料对白酒酒质的影响。

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Research of bound aromas based on acid hydrolysis in glutinous and non-glutinous sorghums

LU Jia-hui1,21,2FANWen-lai1,21,2XUYan1,2

(1.LabofBrewingMicrobiologyandAppliedEnzymology,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

In order to explore the effect of glutinous and non-glutinous sorghums on Chinese liquor’s quality, the SPE column was used for adsorbing bound precursors, and then, which were hydrolyzed by acid to release volatile compounds. The HS-SPME coupled with GC-MS was employed to identify and quantify sorghums’ bound aroma compounds. 21 kinds of aroma compounds were detected in two sorghums, including 5 alcohols, 7 aldehydes and ketones, 5 aromatic compounds, 3 terpenoids and 1 furan. Among these, 3 volatiles were identified tentatively. The total content of glutinous and non-glutinous sorghums’ bound aromas was 7 192 μg/kg and 6 922 μg/kg. The content of aroma compounds in the glutinous sorghum was 3.90% higher than in the non-glutinous sorghum and major differences of these compounds were aldehydes and ketones followed by terpenoids. 2,2,6-trimethylcyclohexanone, TDN, isophorone were first detected in sorghums’ bound aromas.

glutinous sorghum; non-glutinous sorghum; bound aromas; HS-SPME

十三五国家重大专项(编号：2016YFD0400500)；国家高技术研究发展计划(863 计划)(编号： 2013AA102108)

吕佳慧，女，江南大学在读硕士研究生。

范文来(1966—)，男，江南大学研究员。 E-mail：wenlai.fan@163.com

2017—01—16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.003