基于UPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术检测龟甲胶中新阿胶成分＊

唐 敏，严建业，2，徐 博，赵小芳，王学生，李顺祥，2＊＊

（1.湖南中医药大学药学院 长沙 410208；2.湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心长沙 410208；山东一笑堂阿胶集团百年制药有限公司 新蔡 463500）

基于UPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术检测龟甲胶中新阿胶成分＊

唐 敏1，严建业1，2，徐 博1，赵小芳1，王学生3，李顺祥1，2＊＊

（1.湖南中医药大学药学院 长沙 410208；2.湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心长沙 410208；山东一笑堂阿胶集团百年制药有限公司 新蔡 463500）

目的：检测龟甲胶中新阿胶特征肽成分。方法：采用胰蛋白酶进行酶解，利用超高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱法（UPLC-ESI-QTOF-MS/MS）对龟甲胶样品进行测定，选定新阿胶特征肽离子m/z 925.4作为检测离子。结果：龟甲胶特征成分含量偏低的样品（但不含有牛皮元和驴皮元特征肽成分）中检测出新阿胶特征肽离子m/z 925.4信号，其MS/MS裂解规律与文献报道一致，而龟甲胶标准品中未检测出该特征肽信号。结论：该方法专属性强、灵敏度高，可检测出龟甲胶中是否掺杂新阿胶成分，可用于龟甲胶的质量控制。

UPLC-ESI-QTOF-MS/MS 新阿胶 龟甲胶 肽段

根据2015版中国药典记载，龟甲为龟科动物乌龟Chinemy sreevesii（Gray）的背甲及腹甲，龟甲胶是龟科动物乌龟的背甲及腹甲经水煎煮、浓缩制成的固体胶。龟甲胶在历版《中国药典》中均有收载，是中国名贵药材。其味甘、咸，性平，归肝、肾经，可滋阴，补血[1]，主治阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄。近年来，由于其价格昂贵，以致乌龟被过度捕杀，其资源面临严重短缺。诸多报道称，一些不良厂家为了节省成本，利用其它来源的动物甲壳和皮革为原料来生产龟甲胶，其中包括在原料中掺杂猪皮来生产龟甲胶的情况。

胶类药材是指由动物的皮革、骨骼等加工而成的胶原蛋白水解肽[2]。近年来，胶类物质在世界范围内均被广泛使用，据相关报道数据分析[2]，胶类产品每年生产量已超32万吨，其中猪皮胶的产出就占据46%。猪皮胶亦称新阿胶，是动物猪Sus scrofadomestica Brisson的皮去毛熬制而成的胶块，其标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第19册。由于猪皮资源比较丰富，且价廉易得，从而常被不良商家作为原料用于生产其他胶类以牟取暴利。同时从一些宗教信仰层面考虑，掺杂了新阿胶的其他胶类在消费和使用方面也受到一定限制[3]。根据不同动物的同类型胶原蛋白的氨基酸序列存在差异[4]，其胰蛋白酶水解产物所含肽段之间存在差异性。利用蛋白质酶切技术和基于HPLC-MS的多肽识别技术，找出这种差异，是鉴别胶类药材的关键所在[5-7]。近年来，该分析方法日趋成熟[8-11]，而被广泛用于胶类制剂的检测。现行的《中国药典》及其补充批件中对龟甲胶的检测项目只对龟甲胶特征肽、牛皮元特征肽和驴皮元特征肽的检测有要求，但未包括新阿胶特征肽的检测项目。在龟甲胶的实际检测工作中发现部分不合格产品中虽可检测出龟甲胶特征肽，且该产品中未检测出牛皮元和驴皮元特征肽，但龟甲胶特征肽含量偏低，此时应考虑是否掺杂新阿胶成分的情况。据文献报道[12-14]，新阿胶经酶解后的产物中可检测出特征肽段离子m/z 925.4、m/z 774.3、m/z 739.8信号，以上三个特征肽段离子是龟甲胶酶解产物所不含有的，因此可通过对新阿胶酶解产物中特征肽离子进行检测，判断龟甲胶产品中是否掺杂了新阿胶成分，可用于龟甲胶的质量控制。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters Acquity超高效液相系统（Waters公司），Waters-Xevo-G2-QTOF质谱系统（Waters公司）；ACQUITY UPLC-BEHC18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）（美国Waters公司）；Mettler MS205DU型电子分析天平（德国METTLER公司）；KQ5200型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；ELGA PURELAB OPTION-R 7超纯水仪（英国ELGA公司）。

1.2 试药

亮氨酸脑啡肽（美国 Waters公司，批号：700008842-1）；甲酸（德国 CNW公司，批号：N030K060）、乙腈（色谱纯，德国MERCK公司，批号：1746030430）均为色谱纯；V5117序列分析级胰蛋白酶（美国Promega公司，批号：00001807271）；NH4HCO3（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20150119）；龟甲胶对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121693-201301）；龟甲胶样品选自本实验室检测过程中发现的不合格样品，其龟甲胶特征肽含量较低，但未被检测出牛皮元和驴皮元成分，共计4批。另加一组龟甲胶标准品作为对照。

2 方法

2.1 液相条件

流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，进行梯度洗脱（0-2 min，5%B→20%B；2-4 min，20%B→50% B；4-6 min，50%B→99%B；6-7 min，99%B；7-10 min， 99%B→5%B；10-11 min，5%B）；流速为0.3 mL·min-1；柱温为40℃；进样量为1 μL。

2.2 质谱条件

离子化模式为ESI+，毛细管电压为3 kV，锥孔电压为40 V，除溶剂温度为450℃，除溶剂气体为600 L·h-1。离子源温度为120℃。对龟甲胶特征离子m/z 631.3→546.2、牛皮元特征肽离子m/z 641.3→726.3、驴皮元特征肽离子m/z 539.8→612.5、新阿胶特征肽离子m/z 925.4→832.6进行质谱分析，采集方式为MS/MS，采集时间11 min，扫描范围100-1500 amu，扫描时间为0.2 s。锥孔电压为40 V，碰撞能量为25 V。碰撞气体为高纯氩气。

2.3 样品处理

取龟甲胶样品（其龟甲胶特征肽成分含量偏低，且不含牛皮元和驴皮元成分）4批，各批样品均称取0.1 g，分别置于50 mL量瓶中，加1%NH4HCO3溶液溶解并定容至刻度，过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液100 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析纯胰蛋白酶适量，加1% NH4HCO3溶液溶解，制成每1 μL中含1 μg胰蛋白酶的溶液）10 μL，摇匀，37℃恒温酶解12 h，得供试品溶液1-4。

2.4 对照品溶液制备

称取龟甲胶标准品0.1 g，置于50 mL量瓶中，处理方法同“2.3”，制得对照品溶液。

3 结果与分析

3.1 试验结果

4批龟甲胶样品中均可检测到龟甲胶特征肽离子m/z 631.3→546.2信号，但积分偏低，未检测到牛皮元特征肽离子m/z 641.3→726.3和驴皮元特征肽离子m/ z 539.8→612.5信号，均检测到新阿胶特征肽离子m/z 925.4→832.6信号，试验结果见表1，新阿胶特征肽m/z 925.4→832.6和龟甲胶特征肽m/z 631.3→546.2质谱提取离子峰见图1。新阿胶特征肽离子MS/MS裂解规律与文献报道一致[7]，该特征肽段的氨基酸序列为GEPGPTGVQGPPGPAGEEGK（图2）。

3.2 方法学考察

3.2.1 精密度试验

取龟甲胶样品1，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，以新阿胶特征肽离子m/z 832.6和龟甲胶特征肽子离子m/z 546.2作为选择离子进行检测，连续测定6次，新阿胶特征肽离子m/z 832.6的保留时间分别为2.71、2.69、2.71、2.71、2.71、2.71 min，平均值为2.70 min，RSD为0.30%（n=6）；龟甲胶特征肽子离子m/z 546.2的保留时间分别为2.97、2.95、2.97、2.97、2.97、2.97 min，平均值2.97 min，RSD为0.28%（n=6），表明本方法精密度良好。

3.2.2 稳定性试验

取龟甲胶样品1制得的供试品溶液，以新阿胶特征肽离子m/z 832.6和龟甲胶特征肽子离子m/z 546.2作为选择离子进行检测，分别于0、2、4、6、8、10 h测定，结果2个特征峰均可被检出，新阿胶特征肽m/z 832.6的保留时间分别为2.71、2.71、2.75、2.71、2.75、2.71 min，平均值为2.72 min，RSD为0.77%；龟甲胶特征肽子离子m/z 546.2的保留时间分别为2.97、2.97、2.99、2.95、2.99、2.95 min，平均值为2.97 min，RSD为0.60%，说明供试品溶液在10 h内均可满足定性需要。

3.3 讨论

猪皮的来源丰富，且价廉易得，常被不良商家作为原料用于生产名贵胶类产品以牟取暴利。同时，从一些宗教信仰层面考虑，原料中掺杂了猪皮的胶类产品在消费和使用方面会受到一定的限制，对胶类制剂中新阿胶成分的检测显得十分必要。现行的药典标准利用LC-MS技术对龟甲胶中龟甲胶特征肽的检测只限于定性而没有定量要求，其补充批件中只对牛皮元和驴皮元有定性和定量要求，均未涉及对猪皮元成分的检测项目，因此在一定程度上存在不足。在对龟甲胶的实际检测过程中发现，有部分不合格产品中虽可被检出龟甲胶特征肽，但含量偏低，且未被检出牛皮元和驴皮元成分。因此，应该考虑此类龟甲胶样品的生产原料中可能掺杂了除牛皮和驴皮以外的其他动物甲壳或皮革。根据文献报道[15]，由猪皮熬制的新阿胶的酶解产物中含有特征肽段GEPGPTGVQGPPGPAGEEGK、GETGPAGPAGPVGPVGAR和TGETGASGPPGFAGEK，利用LC-MS技术对此类特征肽进行分析，可从胶类制剂中检测出是否含有猪皮元成分。鉴于以上分析，一方面建议龟甲胶检测项目中除对龟甲胶特征肽的定性要求外，应该增设其定量标准；另一方面建议龟甲胶检测项目中还应增设对新阿胶成分的检测项目。

本试验选定新阿胶酶解产物中含有的特征肽段离子m/z 925.4进行MS/MS质谱分析，在选择液相条件时发现，与药典中55 min梯度洗脱时间相比，由于本试验选用的色谱柱为ACQUITY UPLC-BEHC18（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），将梯度洗脱时间缩短至11 min，同样取得了很好的试验结果。新阿胶胰蛋白酶水解产物中除特征肽离子m/z 925.4外，m/z 774.3和m/z 739.8应该同样可以作为检测胶类制剂中是否含有猪皮元成分的指标，该方案虽在本研究中未被应用，但将会在后续研究中重点考察。本研究利用UPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术，针对新阿胶酶解产物所含特征肽段离子m/z 925.4进行分析，检测龟甲胶中是否掺杂猪皮元成分，本方法专属性强，灵敏度高，可作为现行龟甲胶检测项目的有力补充。

参考文献

1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社,2015:181.

2 Karim A A,Bhat R.Fish gelatin:properties,challenges,and prospects as an alternative to mammalian gelatins.Food Hydrocolloids,2009,23 (3):563-576.

3 Venien A,Levieux D.Differentiation of gelatins using polyclonal antibodies raised against tyrosylated bovine and porcine gelatins.J Immunoass Immunoch,2005,26(3):215-229.

4 Nemati M,Oveisi M R,Abdollahi H,et al.Differentiation of bovine and porcine gelatins using principal component analysis.J Pharm Biomed Anal,2004,34(3):485-492.

现在的公司，更多的注重生产，产品的生产力成为一个企业发展的重要依据，因此，更多的企业对技术工人的重视程度越来越高，会计专业的难度，也造成了会计人才的稀缺，高工资高待遇往往出现在大型企业中，中小企业无力与其竞争，这些问题导致了很多企业的财务管理队伍不成熟，甚至人员都不健全，企业发展离不开财务管理，管理者一定要重视财务管理队伍建设，加大投入，只有将财务工作做好，公司才能合理的依据盈亏情况对今后的发展进行规划，当今社会，人才是最重要的，重视财务管理队伍建设，为公司今后的发展奠定良好的基础。

5 Xie H,Gilar M,Gebler J C.Characterization of protein impurities and site-specific modificationsusing peptide mapping with liquid chromatography and data independent acquisition mass spectrometry. Anal Chem,2009,81(14):5699-5708.

6 程显隆,李文杰,张小龙,等.UPLC-QTOF-MS结合主成分分析法用于龟甲胶、鹿角胶中添加牛皮源成分的检测研究.药物分析杂志, 2012,32(6):931-935.

7 Cheng X L,Wei F,Xiao X Y,et al.Identification of five gelatins by ultra performance liquid chromatography/time-of-flightmass spectrometry(UPLC/Q-TOF-MS)using principal component analysis. J Pharm Biomed Anal,2012,62(2):191-195.

8 王前,张贵锋,刘涛,等.基于串联质谱的鱼皮明胶鉴别研究.中国生物工程杂志,2009,29(6):101-107.

9 刘荣霞,果德安,叶敏,等.液质联用技术(LC/MS)在中药现代研究中的应用.世界学技术-中医药现代化,2005,7(5):33-40.

10孙爱梅,张贵锋,倪文,等.胶原蛋白降解物高效液相色谱/质谱联用分析.中国生物工程杂志,2005,25(2):66-72.

12 Zhang G F,Liu T,Wang Q,et al.Mass spectrometric detection of marker peptides in tryptic digests of gelatin:A new method to differentiate between bovine and porcine gelatin.Food Hydrocolloid, 2009,23(7):2001-2007.

13 Yilmaz M T,Kesmen Z,Baykal B,et al.A novel method to differentiate bovine and porcine gelatins in food products:NanoUPLCESI-Q-TOF-MS E,based data independent acquisition technique to detect marker peptides in gelatin.Food Chem,2013,141(3):2450-2458.

14李松林,宋景政,乔春峰,等.应用液相色谱质谱联用技术进行中药质量控制.世界科学技术-中医药现代化,2010,12(3):395-400.

15程显隆.胶类药材质量控制关键技术研究.北京:北京中医药大学博士学位论文,2014:38-39.

Identification of Pig-Hide Gelatin from Tortoise-Shell Glue by UPLC-ESI-QTOF-MS/MS

Tang Min1,Yan Jianye1,2,Xu Bo1,Zhao Xiaofang1,Li Shunxiang1,2
(1.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China;2.Hunan Province Engineering Research Center of Bioactive Substance Discovery of TraditionalChinese Medicine,Changsha 410208,China)

This study aimed at identifying pig-hide gelatin from tortoise shell glue using ultra-performance liquid chromatography-electrospray-time of flight mass spectrometry(UPLC-ESI-QTOF-MS/MS).The samples of tortoise shell glue were digested by trypsin before the analysis on UPLC coupled with QTOF mass spectrometry.The ions at m/z 925.4 were selected as the marker peptides of pig-hide gelatin.It was found that the test results of the ions at m/z 925.4 were positive in the samples with low contents of the marker peptides of tortoise shell glue,indicating the existence of pig-hide gelatin.However,the result of bovine-hide gelatinordonkey-hide gelatin was negative,while negative results were detected in tortoiseglue standard.The finding was in conformity with previous references over the fragmentation regularity of MS/MS.In conclusion,the method can be adopted to identifying the pig-hide gelatin from tortoise shell glue and applied to the quality control of tortoise shell glue with high specificity and sensibility.

Ultra-performance liquid chromatography-electrospray-time of flight mass spectrometry,pig-hide gelatin, tortoise shell glue,peptide

10.11842/wst.2017.02.024

R283.3

A

（责任编辑：陈 宁，责任译审：朱黎婷）

2016-11-13

修回日期：2016-12-10

＊ 国家中医药管理局“药用植物学”重点学科课题（国中医药发[2009]30号），负责人：李顺祥；湖南省教育厅“中药学”重点学科（湘教通[2011]76号），负责人：李顺祥；湖南省教育厅高校科技创新团队（湘教通[2010]212号），负责人：李顺祥。

＊＊ 通讯作者：李顺祥，本刊编委，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：中药成分与资源研究。