HPLC法测定不同采收期茵陈中绿原酸和咖啡酸的含量

刘媛媛

HPLC法测定不同采收期茵陈中绿原酸和咖啡酸的含量

刘媛媛

（江苏省中医院药学部，南京210019）

目的用HPLC法测定不同采收期2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月份采集的茵陈样品中绿原酸和咖啡酸的含量，为确定其合适的采收季节提供理论依据。方法收集不同采收期2、3、4、5、6、7、8、9、10、11月份采收的茵陈样品。采用Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-0.3%磷酸水为流动相进行梯度洗脱；柱温：30℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm。结果绿原酸和咖啡酸均在一定浓度内呈良好的线性关系。不同采收期茵陈样品中绿原酸的含量均高于咖啡酸的含量，绿原酸在4月份达到峰值，咖啡酸在5月份达到峰值，并且春季样品含量明显优于其他时间采收期。结论茵陈同一入药部位不同采收期绿原酸和咖啡酸的含量均会发生变化，综合考虑4~5月份为茵陈的最佳采收期。该含量测定方法稳定、有效，可为茵陈质量标准评价提供依据。

茵陈；HPLC；绿原酸；咖啡酸

茵陈，别名牛至、田耐里、因尘、马先、绵茵陈、绒蒿、白蒿、细叶青蒿、安吕草，为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisia capillaries Thumb.的干燥地上部分。全国各地均有分布。主产于四川、河北、山西等省。商品通称绵茵陈，陕西产者称西茵陈，质量最佳。性苦、辛，微凉。归脾、胃、肝、胆经。茵陈具有清利湿热，利胆退黄之功。主治：黄疸、小便不利、湿疮瘙痒、传染性黄疸型肝炎。用于黄疸尿少，湿温暑湿，湿疮瘙痒。现代研究表明，茵陈主要含有有机酸、黄酮、香豆素、烯炔等化学成分，其中绿原酸和咖啡酸为茵陈的主要成分之一，绿原酸具有广泛的生物活性，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用[1]。咖啡酸具有抗菌，抗病毒，中枢兴奋，解毒，凝血的作用。茵陈于春季幼苗高6～10 cm时采收或秋季花蕾长成至花初开时采割，除去杂质及老茎，晒干。介于茵陈有两个采收期，春季和秋季采收，春季采的习称“绵茵陈”；秋季采的习称“茵陈蒿”。所以本实验将采用HPLC方法反相色谱，测定不同采收期茵陈中绿原酸和咖啡酸的含量，为茵陈质量标准评价提供实验数据[2]。

1 仪器与材料

1.1 仪器高效液相色谱仪：美国安捷伦1260高效液相色谱仪（美国惠普公司）：包括DEABL00204低压四元泵；DEAAK03494柱温箱；DEAAN00315自动进样器；DEAAX00613紫外检测器）；色谱柱：安捷伦Hedera ODS-3；Size:250 mm×4.6 mm，5 μm。

其他设备：BP112型电子天平（德国satorius公司）；Millipore超纯水制备系统(美国）。

1.2 试药绿原酸对照品（111831-201001中国药品生物制品检定所提供）；咖啡酸对照品（110885-200102中国药品生物制品检定所提供）；茵陈样品均来自于陕西，分别为10个不同采收期2~11月份，经鉴定为科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisia capillaries Thumb.的干燥地上部分（见表1）；乙腈（Tedia美国，色谱纯）；甲醇（上海化学试剂有限公司）；冰乙酸（上海化学试剂有限公司)；双蒸水实验室制备并经过0.45 μm滤膜过滤。

表1 茵陈样品信息来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A乙腈-B0.3%磷酸水进行梯度洗脱（见表2）；柱温：30℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm[3-4]。结果见图A、B。

表2 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备精密称定绿原酸、咖啡酸对照品1.056 mg、1.134 mg，以甲醇定容在10 ml棕色容量瓶中，再分别吸取已经定容的绿原酸和咖啡酸对照品溶液各4 ml，以甲醇稀释定容在10 ml的棕色容量瓶中，得到浓度为绿原酸42.24 μg/ml、咖啡酸45.36 μg/ml的对照品混标溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备精密称定10批不同采收期的茵陈样品粗粉2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%的甲醇50 ml，加热回流提取2次，每次1 h，过滤，合并两次滤液，蒸干，以甲醇溶解残渣，定容在10 ml棕色容量瓶中，4℃冰箱避光保存备用，使用前以0.45 μm滤膜过滤。

图A混标对照品HPLC图

图B供试品溶液HPLC图

2.4 线性关系的考察按上述色谱条件分别进样对照品混标溶液5 μl、8 μl、10 μl、15 μl、20 μl，记录峰面积与对照品浓度计算回归方程得分别为绿原酸、咖啡酸，浓度范围见表3。

表3 绿原酸、咖啡酸线性关系

2.5 精密度试验精密吸取同一浓度混标溶液，按上述色谱条件连续进样6次，每次进样10μl，根据峰面积，计算绿原酸和咖啡酸的RSD分别为0.12%、0.08%（n= 6），实验结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验精密吸取同一浓度的混标溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h分别进样，按上述色谱条件每次进样10 μl，根据峰面积，计算绿原酸和咖啡酸的RSD分别为2.14、1.19%，实验结果表明该方法在12 h内稳定。

2.7 重复性实验取同一批供试品2 g精密称定，平行制备6份，按色谱条件下进样，每次进样10 μl，根据峰面积与对照品浓度，计算样品中的绿原酸和咖啡酸含量。所得结果绿原酸含量RSD为1.23%、咖啡酸含量RSD为1.58%。实验结果表明该方法重现性良好。

2.8 加样回收实验取同一批供试品2 g共6份，精密称定，平行制备，分别加入一定浓度的绿原酸、咖啡酸混标对照品溶液，按上述上述色谱条件相同条件进行样品处理和进样分析得到绿原酸、咖啡酸含量。进行加样回收率实验测定，根据结果计算RSD分别为绿原酸99.12%、100.23%、100.72%、99.83%、101.52%、100.21%；咖啡酸100.57%、99.23%、99.92%、99.63%、98.99%、99.95%。结果显示，回收率良好。

2.9 样品的含量测定见表4。本实验收集了来自同一产地(陕西)，全年不同月份所采收的茵陈，按照上述色谱条件进行检测。

表4 同年不同时间采收茵陈绿原酸、咖啡酸含量测定结果（mg/g）

3 结果与讨论

3.1 结果本实验采用HPLC方法对不同采收期的茵陈进行了绿原酸和咖啡酸的含量测定，结果显示，出自同一产地不同采收期的茵陈其两种目标性化合物的含量随着季节的变换而发生改变，总体来说绿原酸含量在各个不同采收期均高于咖啡酸的含量，同年4~5月份采收的茵陈绿原酸和咖啡酸的含量均较高，由此可以认为全年4~5月为茵陈的最佳采收期。此外，尤其两种成分含量差异较大，所以绿原酸和咖啡酸只能作为评价茵陈质量的指标性成分之一，而不能全面评价茵陈的质量好坏。

3.2 讨论按本文中的检测方法，均能使目标性成分绿原酸和咖啡酸达到完全分离，并且基线平稳，能较好对绿原酸和咖啡酸进行定性和定量，系统性实验显示结果较好。同时也考察了不同的流动相对实验结果的影响，分别是乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.3%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.3%四种流动相，发现磷酸洗脱的峰形明显优于甲酸，0.3%的磷酸峰形优于0.1%的磷酸，所以本实验选择了乙腈-0.3%磷酸进行梯度洗脱。由于绿原酸的最大吸收波长为327 nm，咖啡酸的最大吸收波长为320 nm，结合综合因素，所以选择了325 nm为检测波长。并且进行了多种方法学考察，证明使用该方法进行测定稳定、可靠、重现性好。

[1]谢韬，梁敬钰，刘净.茵陈化学成分和药理作用现代研究进展[J].海峡药学，2007，1(1):23-25.

[2]王如意，欧乔英，周伟明.十批茵陈中药材的质量分析研究[J].黑龙江医药，2015，28(4):737-738.

[3]黄志恒.HPLC法测定蒲公英中绿原酸、咖啡酸及阿魏酸的含量[J].中国民族民间医药，2014，22(2):21-23.

[4]舒详，陈军，林世和，等.白英不同生长期不同药用部位绿原酸与咖啡酸及芦丁含量测定[J].医药导报，2012，31(8):1062-1064.

Content Determination of Chlorogenic Acid and Caffeic Acid in Virgate Wormwood Herb in Different Harvest Periods by HPLC Method

LIU Yuanyuan
(Pharmaceutical Department,Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210019,China)

Objective Determination of different harvest period in February,March,April,May,June,July,August,September,October,November of chlorogenic acid and caffeic acid in virgate wormwood herb sample by HPLC method,to provide a theoretical basis for determining the appropriate harvest season.Methods The different harvest period in February,March,April,May,June,July, August,September,October,November of chlorogenic acid and caffeic acid in virgate wormwood herb sample was collected.The Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5μm)chromatographic column was used,0.3%acetonitrile-phosphate water as mobile phase in gradient elution.Column temperature was 30℃.Flow rate was 1.0 ml/min.The detection wavelength was 325 nm.Results The chlorogenic acid and caffeic acid had good linear relationship within a certain concentration.In different harvest time,the content of chlorogenic acid was higher than that of caffeic acid.The chlorogenic acid reached peak in April peak,and caffeic acid reached peak in May.The spring sample content was better than the rest of the year.Conclusion The different harvest time of virgate wormwood herb on the same section as the content of chlorogenic acid and caffeic acid changed.Through considering,the best harvest time is April and May.The content determination method is stable and effective,and can be applied to assess the quality standard of virgate wormwood herb.

virgate wormwood herb;HPLC;chlorogenic acid;caffeic acid

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.07.064

1672-2779（2017）-07-0139-03

：李海燕本文校对：付金柏

2016-12-23）