呼吸道感染流感嗜血杆菌生物学分型及耐药基因研究

周世娟++刘运香++林华杰++余进胜++徐洁玲

[摘要]目的 调查Hi的阳性率、生物学分型和耐药情况。方法 2015年1月～2016年12月从惠东县人民医院门诊及住院患者呼吸道标本中分离流感嗜血杆菌共200株，用法国梅里埃系统API NH进行鉴定确认生物型，并同时检测β-内酰胺酶。采用K-B纸片扩散法对12种抗生素进行药敏实验。根据药敏结果，对于有对β-内酰胺酶类抗生素产生耐药性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型别，PCR检测TEM-1和ROB-1基因。统计不同生物型的β-内酰胺酶、抗生素耐药率、基因检出率。结果 共检出Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6种生物型，其中比例最高的是Ⅲ型，占38%；其次是Ⅱ型，占25%。Ⅴ型、Ⅷ型未见对12种抗生素耐药。Ⅳ型对于抗生素的耐药率最高，对于氨苄西林、头孢呋辛、头孢他定、氨曲南、阿奇霉素均产生耐药。35.16%的菌株对氨苄西林等β-内酰胺类抗生素呈现耐药性。34.04%菌株产生β-内酰胺酶，TEM-1阳性率为54.26%，ROB-1为6.38%。结论 惠东县人民医院收集的呼吸道感染流感嗜血杆菌的生物型有Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6种，以Ⅱ型、Ⅲ型为主，Ⅳ型亦占一定比例。Ⅴ型、Ⅷ型未见对12种抗生素耐药。Ⅳ型对于抗生素的耐药率最高。对氨苄西林等β-内酰胺类抗生素，耐药机制以质粒介导的TEM产β-内酰胺酶型为主，少数为ROB-1介导。关注Hi致病生物型的流行情况，对于合理选择抗生素具有重要意义。

[关键词]流感嗜血杆菌；生物型；耐药；基因

[中图分类号] R378.4+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（a）-0162-04

[Abstract]Objective To investigate the positive rate，the biological type and the drug resistance of Haemophilus influenzae.Methods 200 strains of Haemophilus influenzae were separated from outpatient and hospitalized patients of Huidong County People′s Hospital from January 2015 to December 2016.Biological types and beta lactamase were identified with API NH of France bioMerieux identification system.The drug sensitivity test of 12 antibiotics was performed by K-B disk diffusion method.According to the results of drug sensitivity，TEM-1 and ROB-1 gene of the strains of Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，and Ⅳ biotypes were detected by PCR.Results There were 6 biotypes，which were type Ⅰ-Ⅴ，and Ⅷ type.The highest proportion was type Ⅲ （38%） and type Ⅱ （25%）.Type Ⅴ，type Ⅷ was sensitive to 12 antibiotics.Type Ⅳ had the highest antibiotic resistance rate of Ampicillin，Cefuroxime，Ceftazidime，Aztreonam and Azithromycin.35.16% of the strains showed resistance to Ampicillin and other beta lactam antibiotics.34.04% strains produced beta lactam.The positive rate of TEM-1 gene was 54.26%，while the positive rate of ROB-1 gene was 6.38%.Conclusion There were 6 biological type of Haemophilus influenzae in Huidong County People′s Hospital.Type Ⅱ and type Ⅲ were the dominant biotypes，and Ⅳ type also shared a certain proportion.Type Ⅴ，type Ⅷ was sensitive to 12 antibiotics.The biological type which was highest resistance to antibiotics would be type Ⅳ.The production of beta lactamase is mainly mediated by TEM，and just a few strains mediated by ROB-1.To pay attention to the epidemic situation of Hi is of great significance for the selection of antibiotics.

[Keywords]Haemophilus influenza；Biological type；Drug resistance；Gene

作為呼吸道感染常见致病病原体的流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，Hi）对常见抗生素的耐药率有增高趋势，重视和加强Hi的流行病学调查及耐药性监测工作，特别对于儿童和老年患者，对提高患者治愈率，控制Hi耐药性具有非常重要的意义[1-2]。本研究调查惠东县人民医院Hi的阳性率及生物型分型，了解生物型与产β-内酰胺酶及耐药基因的关系，分析生物型与常用抗生素的耐药性的相关性，并统计耐药基因的流行情况，有助于正确分析Hi的耐药机制，合理选择抗生素治疗，提高临床效果，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

2015年1月～2016年12月从惠东县人民医院门诊及住院患者呼吸道标本，包括痰液、咽拭子、肺部灌洗液分离获得的Hi共200株（剔除来自同一患者相同部位的分离菌株）。

1.2 Hi鉴定及生物型分型

根据全国临床检验操作规程，将合格送检标本分别接种于哥伦比亚血平板及含有万古霉素的巧克力平板（梅里埃嗜血杆菌巧克力平板）上，孵育条件：37℃，5%CO2，18～24 h。然后从中挑取无色、透明、湿润小菌落，在血琼脂平皿（广州市迪景微生物科技有限公司）和营养琼脂平皿（郑州博赛生物技术股份有限公司）上用ATCC25923（金黄色葡萄球菌）进行卫星试验，在血琼脂平皿上生长而在营养琼脂上无菌落生长者，初步鉴定为Hi。再用法国梅里埃系统API NH进行鉴定确认（根据API NH中脲酶发酵、吲哚试验和鸟氨酸脱羧酶发酵三个生化反应进行Hi生物分型），并同时检测β-内酰胺酶（梅里埃β-内酰胺酶快速检测试剂盒）。

1.3 药敏试验

采用K-B纸片扩散法，按2014年美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准取0.5麦氏单位Hi菌悬液涂布于Hi专用药敏培养基HTM（Hemophilustestmedium，美国OXOD公司），贴上抗生素纸片，5%CO2、35～37℃培养18～24 h后测量抑菌圈直径并判读结果。抗生素纸片（北京天坛药物有限公司）包括氨苄西林（10 μg/片）、头孢呋辛（30 μg/片）、头孢他定（30 μg/片）、头孢曲松（30 μg/片）、头孢吡肟（30 μg/片）、氨曲南（30 μg/片）、亚胺培南（10 μg/片）、美诺培南（10 μg/片）、环丙沙星（5 μg/片）、左氧沙星（5 μg/片）、阿齐霉素（15 μg/片）、氨苄西林/舒巴坦（10/10 μg/片）等。用Hi质控株ATCC49766（氨苄西林敏感株）、ATCC49247（产β-内酰胺酶阴性、氨苄西林耐药株）用上述药敏纸片对HTM培养基进行质控。应用软件WHONET 5.6进行抗生素敏感性分析，统计中介率、耐药率和多重耐药的情况。

1.4耐药基因检测

根据药敏结果，对于有对β-内酰胺酶类抗生素产生耐药性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型别进行相应的耐药基因检测。参考文献[3]和NCBI数据库中的耐药基因TEM-1、ROB-1序列，合成引物（上海英潍捷基公司），引物序列如下：

TEM-1上游引物5′-ATCAGTTGGGTGCACGAG TG-3′，下游引物5′-CGCTCGTCGTTTGGTATGG-3′；ROB-1上游引物5′-ACCCATACCAATCGGCTAGA-3′，下游引物5′-TGGCGTCTTCGGTAAATTGC-3′。

根據细菌基因组DNA提取试剂盒说明书[天根生化科技（北京）有限公司]提取流感嗜血杆菌 DNA。PCR检测耐药基因（宝生物公司TaKaRa Ex Taq试剂盒，反应体系参照说明书），反应条件为98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 Cycles（LC480 PCR仪产自美国Phoenix 100公司）。用已知产TEM和ROB基因的大肠杆菌作阳性对照；无菌去离子水作阴性对照。

2结果

2.1 Hi的生物分型结果

本研究Hi样本一共检出6种生物型，分别是Ⅰ～Ⅴ型以及Ⅷ型。其中比例最高的是Ⅲ型，占38%；其次是Ⅱ型，占25%；Ⅴ型和Ⅷ型检出率较低（表1）。

2.2 Hi对12种抗生素的药敏实验结果

对于收集的200株Hi进行抗生素敏感性分析，结果显示，耐药率最高的前三种抗生素分别是氨苄西林（35.16%）、阿奇霉素（20.22%）、头孢呋辛（17.58%）。个别菌株检出头孢他定、氨曲南、左氧沙星耐药。对于头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南、美诺培南、氨苄西林/舒巴坦，所有菌株均敏感（表2）。

2.3 Hi不同生物分型的12种抗生素敏感性分析

进一步对检出的6种生物型Hi的药敏结果进行分析。Ⅴ、Ⅷ型Hi均未发现对该12种抗生素耐药的菌株。Ⅳ型Hi的氨苄西林耐药率相对较高，占该生物型菌株的87.00%，其次还有Ⅱ、Ⅲ型，均高于50%。Ⅱ型Hi的头孢呋辛耐药率相对较高，占该生物型菌株的45.45%，其他生物型均低于10.00%。Ⅱ型、Ⅳ型检出头孢他定耐药菌株，占比分别是25.00%、22.22%。Ⅳ型Hi的氨曲南耐药菌株占该生物型菌株的20.00%，Ⅲ型菌株则有7.14%检出耐药。Ⅳ型Hi的阿奇霉素耐药率相对较高，占该生物型菌株的50.00%，其次为Ⅲ型（30.00%），Ⅱ型（18.18%）（表3）。

2.4 Hi不同生物型的耐药基因和β-内酰胺酶检测结果

对于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型Hi共188株，PCR检测耐药基因TEM-1和ROB-1，结合β-内酰胺酶检测结果进行分析。结果显示，4种生物型均检出TEM-1、ROB-1基因，Ⅰ型Hi未检出β-内酰胺酶（表4）。

3讨论

Hi的生物型引起的疾病有所差异，例如Ⅰ型主要致儿童脑膜炎，Ⅱ型、Ⅲ型主要引起上呼吸道感染和肺炎，健康儿童口咽部Hi则以Ⅶ、Ⅷ型占优势。湖南新邵地区检出Ⅰ到Ⅲ、Ⅴ到Ⅷ型7种生物型，以Ⅱ、Ⅲ型为主[3]；苏州地区儿童、山东青岛地区的研究结果亦是以Ⅱ、Ⅲ型为主[4-5]。本研究中，占优势的Hi生物型也是Ⅱ、Ⅲ型，与上述研究一致。武汉地区的调查未分离到Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅷ型，分离到的主要为生物型Ⅵ型，并认为该生物型主要引起肺炎和支气管炎[6]；辽宁丹东地区儿童Hi则以生物型Ⅳ和Ⅵ占优势[7]。本研究也分离了一定数量的Ⅵ型菌株。综合本研究及国内外的数据显示，各地流行的致病Hi生物型不尽相同[8-9]。

氨苄西林是Hi感染的首选治疗药物，但是，多项报道显示，Hi对氨苄西林的耐药性不断上升[10]。在本研究中，氨苄西林的总体耐药率为35.16%。不同生物型Hi对氨苄西林的耐药程度不同，最高的为Ⅳ型（87.00%），Ⅱ、Ⅲ型均高于50.00%。对于第二代头孢菌素头孢呋辛，本地区也发现一定程度的耐药菌株（17.58%），其中Ⅱ型耐药率相对较高，占该生物型菌株的45.45%。第三代头孢菌素——头孢他定检出少量耐药菌株，集中在生物Ⅱ型（25.00%）、Ⅳ型（22.22%）。第三代头孢菌素头孢曲松和第四代头孢菌素头孢吡肟均未发现耐药菌株，同时，上述抗生素无肾毒性，因此可作为难治性Hi治疗的推荐药物。在对于青霉素类和头孢类过敏的患者中，还可使用单环β-内酰胺酶类抗生素，如氨曲南；碳青霉烯类抗生素，如亚胺培南、美诺培南等。本研究药敏结果显示，本院存在部分氨曲南耐药菌株（6.33%），主要为Ⅳ型生物型；收集的菌株对碳青霉烯类抗生素均敏感。上述抗生素均为β-内酰胺酶类抗生素。对于非β-内酰胺酶类抗生素，笔者分析了大环内酯类抗生素阿奇霉素，发现了一定程度的耐药（20.22%），其中Ⅳ型耐药率较高（50.00%）；而喹诺酮类抗生素环丙沙星、左氧氟沙星均未发现耐药。综合比较各个生物型Hi的耐药情况，Ⅳ型对于抗生素的耐药率最高，对于氨苄西林、头孢呋辛、头孢他定、氨曲南、阿奇霉素均产生耐药，提示生物Ⅳ型较易产生耐药，临床应予关注。

细菌对于β-内酰胺酶类抗生素耐药的机制主要是通过产生β-内酰胺酶，水解抗生素的β-内酰胺环，从而使抗生素失活。Hi的β-内酰胺酶可由多种基因編码，其中，由质粒介导的 TEM-1基因较为多见，此外，也有少数由ROB-1基因介导[11-12]。国内外数据显示，β-内酰胺酶产生率为12.8%～38.0%[13-15]。本研究中，β-内酰胺酶整体的阳性率为34.04%，与前人报道一致，其中Ⅳ型β-内酰胺酶产生率最高（60.61%），这也与β-内酰胺类抗生素的药敏实验结果一致；其次是Ⅲ型（44.87%）。对于TEM-1、ROB-1耐药基因检测的结果，亦与β-内酰胺酶、药敏实验结果趋势基本一致（阳性率：Ⅳ型>Ⅲ型>Ⅱ型>Ⅰ型）。同时，TEM-1耐药基因检出率（54.26%）比β-内酰胺酶高（34.04%），提示耐药基因检测的灵敏度高于检测β-内酰胺酶。

综上所述，呼吸道感染Hi的生物型有Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6种，以Ⅱ型、Ⅲ型为主，Ⅳ型亦占一定比例。Ⅴ、Ⅷ型未见对12种抗生素耐药。Ⅳ型对于抗生素的耐药率最高，对于氨苄西林、头孢呋辛、头孢他定、氨曲南、阿奇霉素均产生耐药。35.16%的菌株对氨苄西林等β-内酰胺类抗生素呈现耐药性，耐药机制以质粒介导的TEM-1产β-内酰胺酶型为主，少数为ROB-1介导。因此，关注Hi致病生物型的流行情况，正确分析Hi耐药机制，对于合理选择抗生素进行抗感染治疗具有重要意义。

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（收稿日期：2016-12-27 本文编辑：方菊花）