骨碎补总黄酮对骨质疏松症大鼠BMP—2蛋白表达及血清骨钙素水平的影响

黄松++陈敬有++高皓

[摘要]目的 探讨骨碎补总黄酮对骨质疏松症大鼠BMP-2蛋白表达及血清骨钙素水平的影响。方法 通过摘除大鼠卵巢的方法复制骨质疏松症模型，并将大鼠分成正常组、假手术组、模型组、骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组。手术后第7天开始给药，1次/d，连续12周，HE染色观察大鼠骨组织形态学变化，ELISA检测各组大鼠股骨中BMP-2蛋白表达情况以及血清中的骨钙素水平。结果HE染色结果显示，骨碎补总黄酮组大鼠股骨组织的骨小梁数量、密度、布局及完整性均优于模型组，且大鼠股骨组织中BMP-2蛋白表达量[（13.469±0.215）pg/ml]和血清中骨钙素水平[（1.61±0.09）μg/L]均分别高于模型组的（5.516±0.119）pg/ml和（0.76±0.22）μg/L（P<0.05），接近于假手术组的（15.279±0.211）pg/ml和（1.34±0.17）μg/L（P>0.05）。结论 骨碎补总黄酮治疗骨质疏松症大鼠的效果显著，其作用机制可能是通过上调股骨组织中BMP-2蛋白和血清中的骨钙素水平，进而促进骨组织的形成。

[关键词]骨质疏松症；骨碎补总黄酮；骨形态发生蛋白-2；骨钙素

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（a）-0012-04

[Abstract]Objective To explore the effect of Total Flavonoids of RhizomaDrynariae on BMP-2 protein expression and serum bone gla protein level in rats with osteoporosis.Methods Osteoporosis model was established by removing rat ovary，and the rats were divided into normal group，sham operation group，model group，total Flavonoids of Rhizoma Drynariae group and Caltrate D Tablet group.In the seventh days after surgery，drugs were used once per day for 12 consecutive weeks.Morphological change of bone tissue in rats was observed by HE staining，and the expression of BMP-2 protein and the level of serum bone gla protein level in the femur of rats in each group was detected by ELISA.Results HE staining indicated that the number，density，distribution，and integrity of bone trabecula in the rats femoral bone tissue in the Total Flavonoids of Rhizoma Drynariae group were superior to those in the model group.The protein expression of BMP-2 in rats femoral bone tissue and the level of serum bone gla protein [（13.469±0.215 ） pg/ml and （1.61±0.09） μg/L respectively] was much higher than that in the model group [（5.516±0.119） pg/ml and （0.76±0.22） μg/L respectively] （P<0.05）.The protein expression and serum bone gla protein level was close to that in the sham operation group respectively[（15.279±0.211） pg/ml and （1.34±0.17） μg/L] （P>0.05）.Conclusion In the treatment of rats with osteoporosis，Total Flavonoids of Rhizoma Drynaria can obtain a great effect.The possible mechanism is through up-regulation of BMP-2 protein in the femoral bone tissue and the level of serum bone gla protein，thus promoting the formation of bone tissue.

[Key words]Osteoporosis；Total Flavonoids of Rhizoma Drynaria；Bone morphogenetic protein-2；Bone gla protein

骨質疏松症（osteoporosis，OP）是一种比较常见的疾病，主要是以骨量减少、骨组织微结构退化为特征，导致骨脆性增加，骨折率高发[1]。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一种与骨组织生长相关的多功能糖蛋白，是最主要的骨形成调控因子，能够诱导未分化的间充质细胞分化为成骨细胞和软骨细胞，进而诱导新骨的形成[2-3]，BMP-2是诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一，能够直接反映新骨形成情况。骨钙素（bone gla protein，BGP）是由成骨细胞分泌的一种激素样多肽，比较稳定，不受骨吸收因素的影响，能够反映新形成的成骨细胞的活动状态，是临床上反映骨代谢状况的特异性生化指标[4]。成骨细胞分化末期特异性表达的BGP能调控骨矿物的沉积和转移，促进成骨细胞成熟及骨细胞的形成[5-6]。目前治疗OP的临床药物极多[7]，其中以中药材药物最为突出[8]，中药具有疗效好、副作用小、经济实惠等特点，因此受到了人们的关注。骨碎补总黄酮是中药材骨碎补根茎的提取物，研究发现骨碎补总黄酮对OP导致的骨密度下降有明显的抑制作用[9]，而且还可以在抑制破骨细胞活性的同时促进成骨细胞增殖[10-11]，因此，骨碎补总黄酮是一种常见的治疗老年性OP的中药材，但有关骨碎补总黄酮治疗老年性OP的机制研究还不全面。本研究应用OP动物模型，探讨骨碎补总黄酮对OP模型大鼠血清BGP和BMP-2蛋白的影响，进一步为骨碎补总黄酮有效治疗OP提供新的机制论点。

1材料与方法

1.1实验动物

雌性健康的Wistar大鼠50只，鼠龄5～6个月，体重（243±21）g，未曾交配，购自于湖北省实验动物中心。

1.2实验试剂与仪器

骨碎补总黄酮（商品名：强骨胶囊，生产批号：150412，北京岐黄制药有限公司），钙尔奇D片（生产批号：150710，惠氏制药有限公司），大鼠BGP（OT）ELISA检测试剂盒（上海研谨生物科技有限公司），BMP-2试剂盒（AMEKO），多功能酶标仪（型号：Infinite M200，Tecan），低温高速离心机（型号：ST40R，Thermo），解剖手术器械（上海医疗器械手术器械有限公司）。

1.3动物分组及造模

实验前将动物随机分为两组，正常组（10只）和手术组（40只）。将手术组动物分别沿左右软肋下剪开皮肤，分离皮肤筋膜及腹膜脏层，暴露腹腔，预留假手术组10只，其他大鼠进行结扎及剪除整个卵巢组织，分层缝合后，外层皮肤消毒，正常饲养，手术过程中无大鼠死亡。术后7 d再将手术组存活的大鼠随机分成4组（每组小鼠数量一致，各8只），即假手术组、模型组、骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组。

1.4给药及取材

手术后第7天开始给药，每天上午灌胃1次，连续12周。根据人与大鼠体表面积计算大鼠的骨碎补黄酮和钙尔奇D片用药使用量，正常组、假手术组和模型组以等量的生理盐水灌胃。灌胃期间，每周一对大鼠体表面积进行重新估算，以调整给药剂量。灌胃第12周后，禁食24 h后，眼球取血，-20℃保存。取血后，用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體重肌内注射麻醉后，在无菌条件下，取右后肢股骨干骺端，剥离附着的肌肉及解体组织，充分暴露股骨头，用消毒后的老虎钳将股骨头钳碎，放入无菌的EP管中，做好标记，一部分用于石蜡包埋，一部分用于提取骨组织中的蛋白。

1.5 HE染色

取小鼠股骨组织剪碎成3～5 mm后，经10%甲醛固定，10%硝酸溶液脱钙后，自来水水洗过夜，石蜡包埋，切片厚度为4 μm，至于65℃恒温烘箱烤片6 h左右。将组织切片常规脱蜡至水，水洗1～2 min，苏木精染液染色3～6 min，流水洗去苏木精染液1～2 min，然后放入1%盐酸乙醇1～3 s，稍水洗1～2 s，促蓝液返蓝5～10 s，水洗15～30 s，0.5%伊红染液染色2～3 min，蒸馏水洗1～2 s，80%乙醇15～30 s，95%乙醇15～30 s，无水乙醇1～2 s，分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明2次，每次2～3 s，中性树胶封片。在光学显微镜下（×100），观察各组小鼠股骨组织片HE染色情况。

1.6大鼠股骨中BMP-2蛋白和血清中BGP的测量

按照ELISA检测试剂盒的说明书要求进行，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度值（D），绘制标准曲线，计算大鼠股骨组织中BMP-2蛋白的实际浓度以及各组血清中BGP水平。

1.7统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件分析数据，计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠股骨组织HE染色

如图1A、B所示，正常组和假手术组大鼠股骨组织形态结构完整，骨细胞位于骨髓腔中央，骨髓腔较小，骨小梁粗细一致，相互连接成网络结构，无断裂现象，骨小梁之间间隙较小。模型组大鼠随着卵巢组织被摘除，雌激素分泌减少，骨组织形态结构不完整，骨小梁丢失、断裂严重，骨小梁之间连接点较少，分布稀疏凌乱，游离末端增多，间距增大，骨髓腔融合严重，出现典型的骨质疏松病理形态改变，如图1C所示。骨碎补总黄酮组大鼠股骨组织与模型组相比较，骨小梁增厚，断裂减少，连接点增多，尚可连接成网络结构，骨小梁数量较多，密度增大，排列规则，完整性明显优于模型组，但比正常组和假手术组稍差，如图1D所示。钙尔奇D片组与骨碎补总黄酮组比较，骨小梁断裂较多，结构不完整，连接点较少，具有较多的游离末端；但是与模型组比较，钙尔奇D片组骨小梁数量、密度、连接状态以及完整性均优于模型组，如图1E所示。

2.2 ELISA检测大鼠骨中BMP-2蛋白表达情况

各组大鼠股骨中BMP-2蛋白表达情况如表1所示，钙尔奇D片组和模型组与正常组比较，BMP-2蛋白浓度明显下降（P<0.05）。与模型组比较，骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组差异有统计学意义（P<0.05），提示这两组药物均能显著提高大鼠股骨中的BMP-2蛋白表达，与正常组比较，钙尔奇D片组差异有统计学意义（P<0.05），而骨碎补总黄酮组差异无统计学意义（P>0.05），提示骨碎补总黄酮对OP的治疗效果比钙尔奇D片显著。

2.3大鼠血清的BGP水平变化

模型组与正常组、假手术组比较，BGP浓度下降明显（P<0.05），提示OP中骨代谢异常，BGP水平较低；骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组的BGP浓度高于正常组（P>0.05），骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）（表2），提示骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组能提高OP大鼠血清中的BGP含量，从而促进骨质合成，从结果上看，骨碎补总黄酮组的疗效好于钙尔奇D片组。

3讨论

骨骼是人体重要的一个组成成分，它不仅具有生命力还具有一定的弹性和韧性，赋予人类运动的功能，然而各种骨类疾病的发生给人类的生活质量造成很大影响。BMP是一种存在于骨基质中的酸性糖蛋白，也是一种能够诱导骨组织形成的生长因子，例如能够诱导人体间充质细胞分化为骨、韧带、软骨、肌腱和神经组织[12-13]。骨修复过程受到多种因子的调节，而BMP-2就是其中最重要的调节因子之一。机体受到相应外界信号刺激时，BMP-2与细胞膜上的受体结合，将信息转递至细胞核内，通过转录激活相关物质促进骨组织的再生[14]。BGP是成骨细胞分泌的一种激素样多肽，是骨代谢状况的特异性生化指标，能特异性反映成骨细胞的活性[15]。BGP由成骨细胞分泌后沉积在骨组织的间质细胞外，最后释放至血液中，因此血液中的BGP与骨组织中BGP含量成正相关[16]。雌激素能够通过促进骨样细胞增殖分化和诱导骨细胞成熟，达到促使骨形成的作用[17-18]，而破骨细胞和成骨细胞中也存在雌激素受体，因此常使用摘除动物卵巢的方法制备OP动物模型[19-20]。本研究采用摘除大鼠卵巢的方法复制OP模型，以及通过检测BMP-2蛋白表达以及BGP水平来探讨骨碎补总黄酮组治疗OP可能存在的机制。

根据大鼠股骨组织HE染色结果，可以看出模型组大鼠股骨骨组织形态结构不完整，骨小梁丢失、断裂严重，骨小梁之间连接点较少，分布稀疏凌乱，游离末端增多，间距增大，骨髓腔融合严重，是典型的骨质疏松病理形态改变，说明造模成功。持续给药12周后，骨碎补总黄酮组大鼠骨小梁增厚，断裂减少，连接点增多，同时骨小梁数量较多，密度增大，排列规则，说明骨碎补总黄酮能明显改善OP病情。且模型组中BMP-2蛋白表达量和血清BGP水平与正常组比较显著性降低，说明OP大鼠机体内BMP-2蛋白处于低表达水平，血清BGP处于低水平状态；然而骨碎补总黄酮组与模型组比较，大鼠体内BMP-2蛋白表达和血清BGP处于较高水平状态，说明骨碎补总黄酮组能够提高OP大鼠机体内BMP-2蛋白表达和血清BGP水平。另外，钙尔奇D片组大鼠股骨骨组织骨小梁密度、数量及完整性稍差于骨碎补总黄酮组，优于模型组，大鼠机体内BMP-2蛋白表达和血清BGP水平也稍低于骨碎补总黄酮组，说明骨碎补总黄酮的疗效更佳，因而，骨碎补总黄酮有效治疗老年OP的机制可能是通过提高骨内BMP-2蛋白表达和血清中的BGP水平来实现的。

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（收稿日期：2016-12-25 本文编辑：许俊琴）