阿魏酸调节C—KIT/MITF蛋白表达影响黑素生成的实验研究

李伟+王加志+曲岩+王兴焱+陈景华

[摘要] 目的 探讨不同浓度阿魏酸对UVB诱导的A375细胞黑素生成的影响及其作用机制。 方法 常规体外培养A375细胞，分为空白组、模型组、阿魏酸低浓度（10 μmol/L）组、阿魏酸高浓度（100 μmol/L）组和阳性对照组，除空白组外，各组均以UVB 20 mJ/cm2照射，阿魏酸高低浓度组加含阿魏酸的培养液、阳性对照组加入含熊果苷的培养液作用24 h，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞增殖；采用多巴氧化法研究酪氨酸酶活性的变化；比色法测定黑素含量，免疫印迹法测定C-KIT和MITF蛋白表达。 结果 与空白组比较，模型组细胞酪氨酸酶活性和黑素含量明显增加，阿魏酸低、高浓度组和阳性对照组均可抑制UVB诱导的A375细胞酪氨酸酶活性增高和黑素生成，其机制可能是通过下调C-KIT和MITF蛋白表达而实现的。 结论 高浓度阿魏酸可明显下调C-KIT/MITF蛋白表达，进而抑制酪氨酸酶活性和黑素生成。

[关键词] 阿魏酸；C-KIT/MITF；黑变病；黑素合成

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0028-04

瑞尔黑变病（Riehl's Melanosis）是一种以面颈部灰紫色或灰褐色色素沉着为主要表现的皮肤病[1]。本病在形态学上以色素失禁为主要表现[2]，严重影响患者的容貌，以成年人多见，女性多于男性。皮损主要常见于面颈部。紫外线是本病发生的重要诱因[3]。阿魏酸为苯丙烯酸类化合物，是中药当归的主要活性成分，分子量为194.18。有研究表明[4-5]，阿魏酸有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保护角质形成细胞紫外线损伤等作用。体外研究发现[6-7]，阿魏酸在体外对蘑菇酪氨酸酶呈可逆性的竞争性抑制，而阿魏酸对UVB造成的黑素细胞色素生成作用的影响则未见报导。本研究在前期当归水提液的抗色素作用工作基础上[8]，通过探讨干细胞因子受体（C-KIT）和小眼畸形转录因子（microphthalmia-associated transcription factor，MiTF）蛋白表量差异，分析活性成分阿魏酸对酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）活性和黑素生成的作用机制，为瑞尔黑变病等色素沉着性疾病的治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

阿魏酸标准品（0773-9910）购自中国药品生物制品检定所；人黑素瘤细胞（A375）购于武汉细胞典藏中心；DMEM培养基（Gibco公司）；胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）（BiLLab公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（北京中杉金桥有限公司）；熊果苷、左旋多巴（L-dopa）、TritonX-100、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；小眼畸形转录因子一抗（MITF D5G7V Rabbit mAb #12590），干细胞因子受体一抗（C-KIT D13A2 XPTM Rabbit mAb #3074），甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH抗体（Rabbit mAb #2118），辣根过氧化物酶标记抗兔二抗（#7074）以上抗体均购于Cell Signaling Technology USA。紫外照射仪，紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂），电泳仪、转膜仪（BIO-RAD USA），MK3型酶标仪（热电上海仪器有限公司）。

1.2 细胞培养与受试药

在A375细胞处于对数生长期时，经胰蛋白酶消化，1000 r/min离心5 min，DMEM培养液（含10%胎牛血清）重悬细胞，用红细胞计数板进行计数。阿魏酸配成浓度为2.57 mmol/L的贮备液，通过培养液稀释，最终得到浓度为100 μmol/L～0.01 nmol/L 8个浓度组，将分为空白对照组、模型组、阿魏酸低浓度、阿魏酸高浓度和阳性对照组5组，熊果苷为阳性对照药。模型组和给药组均用中波紫外线（UVB）20 mJ/cm2照射[9]，给药组在照射后给予不同浓度药物作用24 h。

1.3 MTT检测A375细胞的增殖抑制率

将浓度为5.0×104个/mL的A375细胞接种在96孔板中，每孔200 μL，5%CO2，37℃培养12 h，弃培养液，阳性对照组加入含1.1 mmol/L熊果苷的培養基，实验组分别加入含阿魏酸不同浓度的培养基，每孔200 μL，每组设6个复孔，继续培养20 h。弃培养基，每孔加5 g/L的MTT 20 μL继续培养4 h。培养结束后，弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，37℃震荡10 min，酶标仪490 nm测定吸光度值（A）。细胞增殖活性用A490值表示。

1.4黑素含量的测定

调整A375细胞浓度约为4.5×104个/mL接种在6孔板中，每孔2 mL，5%CO2，37℃培养12 h。阳性对照组加入1.1 mmol/L熊果苷，实验组加入含各浓度阿魏酸的培养基，每孔2 mL，每组设6个复孔，继续培养24 h，弃培养基，用PBS清洗2次，经胰酶消化后，加入2 mL DMEM培养基中止消化，吹打成细胞悬液，1500 r/min离心5 min，弃去上清液，然后加入1 mol/L NaOH的100 μL，37℃水浴1 h，再加入400 μL去离子水充分混匀后，吸取100 μL/孔加至96孔板，在490 nm波长测定各孔A值。黑素含量用A490值表示。

1.5 酪氨酸酶（TYR）活性

调整细胞数为1.5×104个/mL接种在96孔板中，每孔200 μL，5%CO2培养12 h。空白组不加细胞，只加培养液，阳性对照组加入1.1 mmol/L熊果苷，实验组加入含阿魏酸各浓度的培养基，每组设6个复孔，每孔200 μL，继续培养24 h，用PBS洗涤2次，每孔加1%Triton-X溶液100 μL，反复冻融使细胞充分裂解。加入0.5%L DOPA溶液50 μL/孔，37℃下反应3 h，490 nm波长处测定各孔A值。TYR活性A490值表示。

1.6 Western blot分析

收集不同浓度阿魏酸作用24 h后的A375细胞，置冰上用RIPA蛋白裂解液充分裂解，14 000 r/min离心15 min，小心收集上清，BCA法测定蛋白浓度。将各受试组总蛋白配成统一浓度后加入5X上样缓冲液混匀，100℃水浴中加热10 min，取50 μg总蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后，电转至PVDF膜（100 V，90 min），5%脱脂奶粉（1XTBST配制）室温封闭1 h，一抗用MITF、C-KIT抗体（1∶1000）4℃孵育过夜，洗膜后用HRP标记的二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，洗膜后用ECL试剂室温反应1 min，凝胶成像系统检测，曝光时间10 s，共10张。内参为GAPDH。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测阿魏酸对A375细胞的增殖抑制率

与空白对照组比较，阿魏酸各浓度下对细胞增殖不产生抑制作用，10、100 μmol/L可以观察到增殖作用趋势，所以本研究组选择这2个浓度作为后续实验的使用浓度，将10 μmol/L浓度组命名为阿魏酸低浓度组，100 μmol/L浓度组命名为阿魏酸高浓度组。见图1。

2.2 阿魏酸对TYR活性及黑素含量的影响

与空白对照组比较，UVB引起的黑素合成和TYR活性显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，阿魏酸各浓度组和阳性对照组均对其产生显著的抑制作用，差异有高度统计学意义（P < 0.01），并呈一定的剂量依赖关系，阿魏酸低浓度组抑制作用弱于阳性对照组（P < 0.05），阿魏酸高浓度组与阳性对照组差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 阿魏酸、UVB对C-KIT和MITF蛋白表达的影响

与空白对照组比较，UVB对MITF和C-KIT蛋白表达有促进作用，而阳性对照药熊果苷和阿魏酸对MITF和C-KIT蛋白表达有显著的抑制作用，呈一定的剂量依赖关系。见图2。

3 讨论

UVB的照射引起黑素生成、转运和代谢异常与C-KIT/MITF/TYR通路调控异常关系密切[10-11]，C-KIT是表达于黑素细胞表面、具有酪氨酸激酶活性的Ⅲ型跨膜受体，属于免疫球蛋白超家族，由原癌基因C-KIT编码，其相对分子量为14 500。己发现瑞尔黑变病在发病前或是发病过程中出现C-KIT表达水平的异常[12]。MITF是SCF/Kit信号转导途径的下游分子，也是TYR等黑素生成重要分子转录调控的分子开关（molecular switchboard）[13-15]，在黑素细胞的发育、分化和功能等方面发挥着重要的作用，这也将成为色素障碍性皮肤病的主要作用靶点[16]。

熊果苷作为常用的脱色剂，有明显的抑制酪氨酸酶活性，减少黑素生成的作用，但已有发生不良反应的报道[17]。为此有必要从中药中寻找有调节黑色素作用又安全的化学物质。根据报道当归及含当归方剂有抑制酪氨酸酶活性的作用[18]，结合本课题组前期工作用基础，本研究以A375细胞为研究对象，当归活性成分阿魏酸为受试药物进行研究。

本研究结果提示，UVB可诱导A375细胞酪氨酸酶活性升高，黑素生成量增加，在作用上则表现为上调C-KIT和MITF蛋白表达，两者呈正相关。阿魏酸在10、100 μmol/L浓度均可降低A375细胞的酪氨酸酶活性并减少黑素生成，下调C-KIT和MITF蛋白表达，但高剂量组作用更明显。体外研究显示出阿魏酸有抑制酪氨酸酶活性的作用，在细胞实验中，阿魏酸作用于膜受体还是被细胞内吞而接触到酪氨酸酶而起作用尚不清楚，本研究所观察到的抑制C-KIT和MITF蛋白表达可能是其抗色素沉着作用的机制之一。黑变病的病位在表皮、真皮层，在治疗上口服药物分布到皮肤的有效药物浓度较低，经皮给药是最佳方案。有研究报道[19]，阿魏酸分子型易透过皮肤，直接作用于病变部位，在充分阐释其作用机制的基础上，有望将阿魏酸开发成为功效型化妆品用于色素性皮肤病的预防或治疗[20]。

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（收稿日期：2016-11-09 本文编辑：苏 畅）