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生长抑制因子5逆转Warburg效应抑制肿瘤增殖的研究

2017-04-06刘新利张鸿飞张旭涛

中国医药导报 2017年6期
关键词:增殖

刘新利++++张鸿飞+++张旭涛+++孟瑾+++张峰

[摘要] 目的 研究生长抑制因子5(ING5)对肺癌A549 细胞Warburg效应的影响。 方法 肺癌A549 ING5过表达细胞系通过慢病毒转染GV218-EGFP-ING5(吉凯基因)构建,空质粒转染为对照细胞系A549-control。Western blot验证ING5的表达;增殖和克隆形成实验观察ING5对A549细胞增殖和克隆形成的影响;乳酸脱氢酶(LDH)活性和乳酸(LD)分泌检测实验观察ING5对A549细胞Warburg效应的影响。 结果 Western blot结果表明,A549-ING5-OE的ING5表达显著高于对照组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。增殖和克隆形成实验结果表明,A549-ING5-OE的增殖和克隆形成能力较对照组显著降低,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。LDH活性和LD分泌检测实验结果表明,A549-ING5-OE的LDH活性和LD分泌较对照组明显降低,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 结论 ING5通过逆转肺癌A549细胞的Warburg效应抑制其增殖。

[关键词] 肺癌细胞;生长抑制因子5;Warburg效应;增殖;克隆形成

[中图分类号] R730.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2017)02(c)-0004-04

代谢重组是诱导肿瘤发生发展的重要机制之一[1-2]。肿瘤组织在有氧条件下主要依赖糖酵解获能的代谢方式称为“Warburg效应”[3]。Otto Warburg首次发现并认为这种代谢方式的转变是促进癌变的主要诱因[4]。生长抑制因子(inhibitor of growth,INGs)是近年来发现的重要抑癌基因家族[5-7],该家族包含ING1~5五个成员。INGs家族蛋白高度保守,由C端结构域、中央区和N端结构域三部分组成[8-9]。ING5是该家族新成员,研究发现ING5与P53相互作用能够抑制细胞生长和诱导细胞凋亡[10]。此外,有研究报道ING5能够抑制肿瘤增殖和上皮间质转化(EMT)[11],同时诱导细胞周期阻滞,促进细胞分化、自噬和凋亡[12]。

目前关于ING5的研究报道较少,其抑癌作用及机制尚无突破性进展。本文拟研究肺癌A549细胞ING5过表达对Warburg效应及增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

A549细胞(上海中科院细胞库),GV218载体(上海吉凯基因化学技术有限公司),G418(美国Gibco公司),高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液(美国HyClone公司),青链霉素混合液(北京Solarbio公司),BCA试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒、裂解液(西安碧云天科技生物有限公司),蛋白酶抑制剂(瑞士Roche公司),ING5抗体(美国Proteintech),ECL化学发光试剂盒(美国Advansta公司),兔二抗(英国Abcam公司),4%多聚甲醛溶液(西安科昊生物技术有限公司)。

1.2 肺癌A549-ING5-OE细胞株的构建

含ING5 cDNA的慢病毒载体和对照载体为吉凯公司构建。0.25%的胰酶消化293T细胞后计数并调整密度为6×105个/mL接种于培养皿,37℃,5% CO2孵箱培养至密度约80%進行转染。转染前2 h换无血清DMEM,加入转染复合物继续培养8 h后弃掉上清液,PBS清洗后加入10% FBS的DMEM继续培养48 h,收集上清液1000 r/min离心3 min,所得上清液为病毒颗粒浓缩液。取对数生长期肺癌A549细胞,用上述病毒颗粒浓缩液进行感染12 h后观察细胞状态,无明显细胞毒副作用则继续培养24 h后换新培养液,感染3 d后观察EGFP基因的表达。感染后的A549细胞计数并调整密度为300个/孔接种于6孔板内继续培养。用5 μg/mL的G418筛选,每隔24 h更换新培养液,筛选3 d后用荧光显微镜观察细胞克隆,挑取阳性克隆扩大培养至所需细胞量。

1.3 Western blot检测ING5的表达

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞,0.25%的胰酶消化,4℃预冷的PBS洗涤、离心后加入适量裂解液混匀冰上裂解30 min。细胞裂解液组成:0.1%SDS、150 mmol/L NaCl、0.5%脱氧胆酸、1%NP-40和50 mmol/L Tris(pH 8.0),裂解前加入蛋白酶抑制剂(1∶25),低温离心机离心30 min后所得上清为细胞总蛋白,BCA试剂盒定量。采用SDS-PAGE凝胶试剂盒配制10%分离胶和6%浓缩胶,上样后开始电泳(浓缩胶100 V,30 min,分离胶130 V,1 h),转膜(100 V,1.5 h),后取出NC膜,10%丽春红染液染色30 s可见清晰的红色条带,裁剪目的条带用PBST洗脱残余染液,5%脱脂牛奶室温封闭1 h后孵育一抗ING5(1∶1000)、Actin(1∶1000),4℃过夜。次日,回收一抗,PBST清洗目的条带3次,7 min/次。山羊抗兔或鼠二抗(1∶5000)室温孵育1 h,PBST清洗目的条带3次,7 min/次。化学发光仪检测目的蛋白的表达。

1.4 细胞增殖实验

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞,0.25%胰酶消化计数后,10% FBS的DMEM配成单细胞悬液,以每孔2×103个/200 μL接种于96孔板中培养,6个复孔。细胞贴壁开始计时24、48、72、96、120 h每孔加MTT溶液(5 mg/mL,PBS配制)20 μL继续孵育4 h后终止培养,弃上清,每孔加150 μL DMSO,震荡仪振荡10 min使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪490 nm测定OD值,以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.5 克隆形成实验

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞,0.25%的胰酶消化计数后,10% FBS的DMEM配成单细胞悬液,以每孔300个/2 mL接种于6孔板中培养,3个复孔。细胞贴壁生长5 d后每孔加500 μL FBS继续培养并观察克隆形成情况,待肉眼观察菌落形成后(14 d左右),弃上清,PBS清洗3次,加1 mL 4%多聚甲醛溶液室温固定15 min。弃固定液,PBS清洗3次,加0.1%结晶紫染液室温染色15 min。弃染液,PBS清洗3次,室温风干后计数超过50个细胞的克隆。

1.6 乳酸脱氢酶(LDH)活性检测实验

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞,0.25%的胰酶消化、4℃预冷的PBS洗涤、离心后加适量裂解液混匀冰上裂解30 min,低温离心机离心30 min,所得上清液为细胞总蛋白,BCA试剂盒定量。根据OD值及线性回归方程计算初始蛋白初浓度,裂解液调整蛋白终浓度为3 μg/μL。按照说明书进行实验操作,酶联免疫检测仪450 nm读取OD值,每组3复孔,重复3次独立实验。

1.7 乳酸(LC)分泌检测实验

取对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞,0.25%的胰酶消化计数后,10% FBS的DMEM配成单细胞悬液,以每孔4×105个/mL接种于6孔板中培养,24 h后收集上清液。按照说明书进行实验操作,酶联免疫检测仪530 nm读取OD值,每组3个复孔,重复3次独立实验。

1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测ING5的表达

Western blot结果表明:与A549-control相比,A549-ING5-OE的ING5表达明显升高,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。

2.2 ING5抑制A549细胞的增殖

增殖实验结果表明:与A549-control相比,A549-ING5-OE的增殖能力显著降低,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。

2.3 ING5抑制A549细胞的克隆形成

克隆形成实验结果表明:与A549-control相比,A549-ING5-OE的克隆形成能力显著降低,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。

2.4 ING5抑制A549细胞的LDH活性

LDH活性检测结果表明:A549-ING5-OE的LDH OD450值为(0.268±0.013),较A549-control的OD450值(0.333±0.015)明显降低,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。

2.5 ING5抑制A549细胞的LD分泌

LD分泌实验结果表明:A549-ING5-OE的LD分泌OD530值为(0.257±0.016),较A549-control的OD530值(0.302±0.012)明顯降低,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。

3 讨论

肿瘤在有氧条件下以糖酵解获能的代谢特征称为Warburg效应[13]。Warburg认为代谢的异常导致了肿瘤的发生发展[14]。此外,Warburg效应导致的局部酸性微环境与肿瘤的浸润转移有明显的相关性[15-16]。Flaveny等[17]研究发现逆转Warburg效应可阻断癌症发展。

近年来INGs蛋白家族在肿瘤中的作用及机制受到高度重视。Liu等[18]发现,ING5与HAT酶Tip60相互作用后诱导凋亡基因Bax和GADD45转录激活促进细胞凋亡。此外,研究发现在口腔鳞状细胞癌[19]、胃癌[20]、乳腺癌[21]和结直肠癌[22]等多种肿瘤中,ING5 mRNA和蛋白水平均显著降低。

本文拟研究ING5过表达对肺癌A549细胞Warburg效应及增殖能力的影响。结果表明,ING5过表达能够显著抑制细胞增殖和克隆形成,同时,首次发现其能够抑制细胞LDH活性和LD分泌抑制糖酵解。提示ING5能够逆转Warburg效应并为肺癌代谢治疗提供新的依据。

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(收稿日期:2016-11-10 本文編辑:程 铭)

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