人胎盘来源的间充质干细胞诱导CD4+CD45RA—CD49b+LAG3+Tr1细胞增殖研究

张焕婷++池颖+++韩之波+曹晓沧

[摘要] 目的 研究人胎盘来源的间充质干细胞（MSC）是否能诱导正常人外周血单个核细胞（PBMC）中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞增殖。 方法 分离、纯化、表型鉴定人胎盘来源的MSC。实验分组如下：PBMC组、PBMC+MSC组、CD3+CD28+PBMC组和MSC+CD3+CD28+PBMC组。相同条件下培养24 h后，流式细胞术检测各组CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞比例；ELISA法检测各组上清中白细胞介素10（IL-10）水平，并对MSC+CD3+CD28+PBMC组中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例和其上清中IL-10含量作相关性分析。 结果 MSC+CD3+CD28+PBMC组中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞比例为（6.66±2.80）%，PBMC组为（1.01±0.44）%，PBMC+MSC组为（1.14±0.78）%，CD3+CD28+PBMC组为（4.20±2.58）%，差异有统计学意义（P < 0.05）。MSC+CD3+CD28+PBMC组上清中的IL-10含量为（14.45±3.14）pg/mL，PBMC组为（0.90±0.05）pg/mL，PBMC+MSC组为（11.00±3.02）pg/mL，CD3+CD28+PBMC组为（6.04±1.90）pg/mL，差异有统计学意义（P < 0.05）。MSC+CD3+CD28+PBMC组中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例与其上清中IL-10含量成正相关（r=0.880，P < 0.01）。 结论 MSC可以诱导CD3、CD28活化的PBMC细胞中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞增殖，CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞比例增加与上清中IL-10水平升高有关。

[关键词] 间充质干细胞；外周血单个核细胞；白介素10；CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0008-05

间充质干细胞（MSC）是一群来源于中胚层的异质细胞。这些细胞能在合适的培养条件下分化为骨、软骨、脂肪甚至神经组织，用于受损组织的修复或治疗免疫性疾病[1-2]。调节性T细胞主要是CD4+细胞群：CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1等。Tr1细胞首先在人类白细胞抗原不相合胎儿肝脏造血干细胞移植形成长期嵌合体的重症联合免疫缺陷患者中发现[3-4]。Tr1与Th0、Th1及Th2最大的区别在于其独特的细胞因子格局：IL-2-/low、IL-4-、IL-5+、IFN-γ+、IL-10+、TGF-β+[5-7]。Tr1细胞本身并不存在于外周血中，而是由CD4+T细胞在抗原反复刺激诱导下产生的。Tr1细胞可通过其分泌的细胞因子治疗多种免疫相关的疾病如哮喘、移植物抗宿主反应疾病等[8-9]，因此在免疫学界的掀起了极大的研究热潮。

研究发现，MSC与PBMC共培养时可以诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg增殖[10-11]。本实验旨在探究MSC与CD3、CD28活化的PBMC共培养时诱导CD4+CD45RA- CD49b+LAG3+Tr1细胞增殖的情况及CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞对上清中IL-10水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基、DF-12培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清（FBS）购于美国Hyclone公司，PE标记的小鼠抗人CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166抗体以及PE标记的小鼠抗人CD4抗体，PE-Cy7标记的小鼠抗人CD45RA抗体，FITC标记的小鼠抗人CD49b抗体，APC标记的小鼠抗人LAG3抗体，同型对照抗体，抗CD3、CD28抗体，IL-10 ELISA检测试剂盒均购自Biolegend公司。人淋巴细胞分离液购自天津灏阳公司。收集2016年3～6月在中国医学科学院血液病医院就诊患者的血样13个，研究经中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准，所有人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 MSC的分离、纯化及鉴定

胎盘由天津中心妇产医院健康足月产产妇捐献，签署知情同意书。将胎盘剪成1 cm3左右的小块，经胶原酶酶II消化、淋巴细胞分离液离心、滤网过滤制备成单个核细胞悬液，调整细胞密度1×106/mL接种于细胞培养瓶置于37℃孵箱中，48 h后换液，弃去未贴壁的细胞。细胞达到70%融合时，胰酶消化，分瓶进行传代培养。3 d换液1次，7～8 d传代1次。扩增大量的3代细胞用于接下来的實验。光学显微镜观察细胞形态，流式细胞术分析MSC表面抗原CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166。

1.2.2 人外周血T细胞的分离

取适量的淋巴细胞分离液置于50 mL的无菌离心管，5 mL肝素抗凝血与等量无菌PBS充分混匀后缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上，2000 r/min离心20 min。将弯头滴管插入云雾层仔细吸取上、中层界面处的云雾层细胞置入另一离心管中，加入10倍体积的RPMI1640液，1500 r/min离心10 min，洗涤2次，弃上清，加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×106/mL。

1.2.3 MSC对各组CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例的影响

取1 mL调整至1×105/mL的第3代MSC接种于6孔板内，完全贴壁后，经60Co照射后弃去培养基。将1 mL PBMC混悬液接种于上述的6孔培养板中，加入CD3+CD28（终浓度20 μg/mL）。实验组分为PBMC、PBMC+MSC、PBMC+CD3+CD28和PBMC+CD3+CD28+MSC 4个组。37℃培养24 h收集细胞，加入由PE、PE-Cy7、FITC、APC分别标记的CD4、CD45RA、CD49b、LAG3抗体，4°C避光孵育30 min，流式细胞术分析CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1的比例。

1.2.4 MSC对各组IL-10水平的影响

取上述4组培养体系的上清，-80℃保存待检。ELISA法检测各组的IL-10水平，具体操作步骤按说明书进行。

1.2.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析以及SNK法多重比较，相关分析采用Pearson分析法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSC的分离、纯化及鉴定

原代分离的MSC只有少数贴壁生长，换液后MSC生长加快，形态不均一。1周后细胞成克隆样生长，2周后细胞成漩涡状生长，3周后细胞汇集成片，融合度达90%，3代后的细胞形态呈均一的长梭形（图1A）。流式细胞术分析MSC表型为：CD14-、CD34-、CD45-、CD29+、CD44+、CD105+、CD106+和CD166+（图1B）。

2.2 MSC对CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例的影响

研究采用CD4、CD45RA、CD49b与LAG3抗体标记鉴定Tr1细胞（图2）。流式细胞术分析各组中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例，MSC+PBMC+CD3+CD28组为（6.66±2.80）%，PBMC组为（1.01±0.44）%，PBMC+CD3+CD28组为（4.20±2.58）%，MSC+PBMC组为（1.14±0.78）%，可见MSC+PBMC+CD3+CD28组中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例最高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.3 MSC对上清中IL-10水平的影响

在相同的培养条件下培养24 h后经ELISA法检测4组上清中的IL-10水平。结果表明MSC+PBMC+CD3+CD28组的IL-10水平为（14.45±3.14）pg/mL，PBMC+CD3+CD28组为（6.04±1.90）pg/mL，PBMC组为（0.90±0.05）pg/mL，MSC+PBMC组为（11.00±3.02）pg/mL。数据分析表明CD3+CD28+PBMC+MSC组的IL-10水平显著高于PBMC+CD3+CD28组和PBMC组（P < 0.05），但与MSC+PBMC组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。此外，MSC+PBMC+CD3+CD28组CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例与其上清中IL-10水平为正相关（r=0.880，P < 0.01）。见图4。

3 讨论

人类MSC具有高度的自我更新和多向分化潜能，在合适的培养基中可向多种组织方向分化，包括成骨细胞、软骨、脂肪、肌肉、肝细胞和神经细胞，因此在组织工程和临床细胞治疗中发挥重要作用[1，12-13]。胎盘来源的间充质干细胞因其取材方便，来源充足，不受伦理的限制，受到国内外免疫学学者的关注[14-16]。许多研究已经发现MSC能够诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg增殖，但MSC是否能够诱导PBMC中的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖还未可知。

Tr1细胞主要是由CD4+T细胞经IL-10诱导产生的，以分泌高水平的IL-10和TGF-β为特征，其可能通过非细胞接触依赖的IL-10分泌发挥抑制效应性T细胞增殖和细胞因子的产生的作用[17]。过去Tr1因缺乏特异性表面标志无法对其进行分析与分离。Groux等[7]发现两个用于鉴定Tr1的选择性表面标志—CD49b与LAG3。本研究利用这两个标志对MSC是否能诱导产生Tr1细胞进行了分析。

本研究发现人胎盘来源的MSC能诱导经CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞增殖。机制可能是MSC本身就具有免疫调节能力，其本身通过分泌IL-10作用于PBMC中的CD4+细胞促进其向CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1方向分化，也可能是MSC分泌的细胞因子作用于PBMC中的单核细胞，如M2型巨噬细胞，促进其分泌IL-10，再作用于CD4+细胞使其向CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1方向分化，CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1细胞分泌的IL-10再作用于CD4+细胞，从而形成正反馈增加Tr1细胞的产生[18-20]。本研究证实MSC可以诱导经CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖，并提高上清中IL-10水平。但IL-10可能来源于CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1細胞，也可能来源于MSC甚至是单核细胞，将来的研究需进一步研究IL-10的来源。本文研究了CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1的比例和上清中IL-10水平的关系，发现MSC与CD3、CD28活化的PBMC共培养后诱导的CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1与上清中IL-10水平有正相关的关系。由此推测共培养上清中增高的IL-10有可能与CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1比例升高有关。

综上所述，本研究发现MSC能诱导CD3、CD28活化的PBMC中CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+Tr1增殖，并能提高培养体系上清中的IL-10水平。本研究为临床应用MSC治疗自身免疫性疾病、过敏性反应、慢性炎症性疾病、移植排斥及肿瘤等因免疫失调引起的疾病提供了新的依据和手段。

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（收稿日期：2016-11-21 本文编辑：李岳泽）