视网膜内环境平衡失调对糖尿病视网膜病变影响的研究进展

秦学维，谢学军

(成都中医药大学，成都610000)

视网膜内环境平衡失调对糖尿病视网膜病变影响的研究进展

秦学维，谢学军

(成都中医药大学，成都610000)

糖尿病视网膜病变(DR)是多元醇代谢异常、晚期糖基化终产物堆积、蛋白激酶C活化、氧化应激、慢性炎症反应等多因素共同导致的，血-视网膜屏障(BRB)破坏以及视网膜新生血管形成是DR最重要的病理改变。影响BRB的作用点是视网膜内环境平衡失调，视网膜内环境平衡系统稳态的破坏可导致内皮素与一氧化氮/一氧化氮合酶系统、血管内皮生长因子与色素上皮衍生因子水平、抗氧化系统与氧化应激产物失衡，从而为DR的发生发展提供条件。

糖尿病视网膜病变；血-视网膜屏障；视网膜内环境平衡失调

糖尿病视网膜病变(DR)是世界最主要的致盲性眼病。DR早期的病理改变主要包括视网膜毛细血管周细胞选择性的丢失、基底膜增厚、毛细血管瘤样增生、血-视网膜屏障(BRB)破坏等，后期则以视网膜新生血管和纤维化为特征。DR发病机制尚不完全清楚，但BRB损伤是DR最主要的病理学基础，也是最早期的形态学改变。目前认为糖尿病引起BRB破坏是多因素共同导致的，包括多元醇代谢异常、晚期糖基化终产物(AGEs)堆积、蛋白激酶C(PKC)活化、氧化应激、慢性炎症反应等，但这些机制最终影响BRB的作用点为破坏了视网膜内各种平衡系统的稳态。

1 内皮素(ET)和一氧化氮/一氧化氮合酶(NO/NOS)系统

与脉络膜循环系统相比，视网膜循环系统是一个低通量的流速恒定系统，能为一个高代谢的活跃组织提供营养。自主神经系统参与调节球后及脉络膜循环，但其神经末梢终止于筛板，因此视网膜及前部视神经乳头无自主神经分布。视网膜血流的调节发生在其血管的微环境内即自身调节。

ET和NO是两种作用相反的血管活性物质，是介导视网膜血流调节的关键因子。生理状态下ET-NO/NOS调节局部血管舒缩状态和维持血管外周阻力，高糖状态下ET-NO/NOS则可通过多种途径参与DR的发生发展。ET是由其氨基酸前体经内皮素转换酶作用生成，有ET-1、ET-2、ET-3三种异构肽，是目前已知的最强有力的血管收缩剂。依赖内皮素的血管收缩是由3种内皮素受体亚型(ETR-A、B和C)介导的[1]。ET-1分布于人眼视网膜血管、脉络膜、虹膜等眼内组织，且血管内皮几乎只产生ET-1，ET-1作用的血管收缩由受体ETR-A介导，ETR-A受体存在于各种血管平滑肌和周细胞[1]。ET-1的合成受多种理化因素影响，白细胞介素-1、肿瘤坏死因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-β、自由基等均可促进ET-1的合成。

高糖状态下，在大量生成AGEs的同时还产生大量的自由基，加之DR慢性炎症反应产生的炎症介质，均可促进ET-1的表达，导致血管收缩，加重组织缺血缺氧。此外，体外实验证实高糖状态下细胞内PKC-β和PKC-δ激活，增加视网膜毛细血管内皮细胞内ET-1 mRNA以及周细胞ETR-A mRNA表达，进一步加重视网膜缺血缺氧，促进DR发生发展[2,3]。

内皮细胞以及血管周围的硝基能神经元是视网膜内NO的主要来源。NO的半衰期很短，不能储存， NOS是产生NO的唯一限速酶，因此常将其作为研究NO发挥作用的机制。NOS包括神经元型NOS (nNOS)、内皮型NOS (eNOS)和诱导型NOS(iNOS)。nNOS和eNOS存在于眼部的多个组织中，但以脉络膜和视网膜内的活性最强。 eNOS定位于血管内皮细胞和Müller细胞，由eNOS催化产生的NO弥散到周细胞或平滑肌细胞表面，并和鸟苷酸环化酶结合，导致血管扩张；由eNOS催化产生的NO还能通过抑制血小板聚集、血小板颗粒分泌、白细胞黏附等来保护血管。nNOS催化产生的NO作为一种递质可调节神经元的活动。iNOS在正常视网膜组织中几乎不表达，但在吞噬了细菌脂多糖及细胞毒素类物质的巨噬细胞以及组织缺血缺氧的刺激下能在视网膜毛细血管的内皮细胞、周细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞等呈高表达，并催化合成大量的NO。由iNOS催化产生的NO可介导各种病理过程，包括组织损伤、细胞凋亡、炎症和局部缺血。

高血糖状态下，一方面由eNOS催化产生的具有生理活性的NO减少；另一方面，由于缺血缺氧刺激，导致视网膜iNOS表达增强，源于iNOS催化产生的NO增加[4]。此外，高糖状态下异常的糖代谢途径产生大量的AGEs以及超氧阴离子，AGEs通过与NO反应以及与NO的载体分子结合，加速NO的灭活；超氧阴离子可以灭活NO从而抑制其扩张血管的功能，且NO与超氧阴离子反应的产物过氧化亚硝酸盐可通过核因子-κB(NF-κ超氧阴离子B)途径进一步增强iNOS转录[5]。有研究证实，高血糖状态下P38MAPK和ERK细胞内信号转导途径被活化，显著上调视网膜细胞iNOS表达，导致iNOS催化产生的NO增加[6]。Leal等[7]研究表明，病理状态下大量的由iNOS催化产生的NO介导了多种病理损伤，如上调内皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达、促进白细胞的黏附损伤以及下调紧密连接蛋白的表达，导致BRB的损伤。nNOS主要存在神经细胞中，由nNOS催化产生的NO具有保护视网膜神经细胞的作用，其机制在于抑制了N-甲基-D-天冬氨酸的神经毒性作用，但糖尿病状态下视网膜nNOS表达下降，致糖尿病视网膜神经细胞功能受损[8]。

2 血管内皮生长因子(VEGF)与色素上皮衍生因子(PEDF)水平失衡

VEGF首先是作为一种增加血管通透性的分子被发现的，广泛分布于人和动物体内多种组织器官如大脑、眼、肝脏、肾脏。VEGF只有一个基因，但剪切成4种不同的形式，分别为 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D ，其中VEGF-A又称血管通透性因子，是DR发生发展中的关键因子，被认为在DR的BRB破坏中有重要作用[9]。VEGF受体(VEGFR)家族包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，VEGFR-2是介导VEGF产生功能的主要受体，主要存于血管内皮细胞[10]。在眼部，视网膜的Müller细胞、周细胞、色素上皮细胞和内皮细胞均能分泌VEGF，但水平及表达程度均较低，这种低分泌以及低表达状态有利于眼部血管正常功能的维持，病理状态下VEGF过度表达将引起血管渗漏以及新生血管形成。

动物实验及细胞培养均表明高血糖、缺氧、氧化应激以及炎症反应均会上调视网膜VEGF表达，VEGF又能上调视网膜局部ICAM-1、PKC等基因表达，造成视网膜白细胞的聚集、BRB破坏[11,12]；高水平的VEGF是导致DR BRB破坏以及新生血管形成的关键因素。Qaum等[13]发现，早期糖尿病实验动物模型1周后VEGF mRNA表达水平比正常对照组高3.2倍，血管渗透性定量检测在8 d后比对照组高1.8倍，并认为早期DR的BRB破坏是VEGF依赖性的，且多局限于小静脉和视网膜表层毛细血管。视网膜局部高水平的VEGF是血管内皮细胞特异性的血管生成与渗漏因子，一方面引起DR视网膜微血管渗透性增高，造成BRB破坏引起视网膜渗出、出血及水肿；另一方面VEGF作为DR中ICAM-1的重要内源性诱导剂，可上调视网膜局部ICAM-1的基因表达，引起视网膜血管内皮细胞中白细胞的黏附聚集，导致内皮细胞及其间的紧密连接破坏，损伤BRB[14]。

PEDF是一种多肽类因子，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族[15]。视网膜色素上皮细胞是眼内PEDF的主要来源，PEDF主要从顶面细胞膜分泌，神经视网膜的外层与RPE顶面接触，通常无血管，这与PEDF抑制新生血管形成的发现一致。目前PEDF被认为是一个重要的保护因子，具有强大的抑制血管再生的作用，也是一种细胞外神经营养因子。PEDF通过Fas-FasL受体区别新生血管的内皮细胞和正常血管内皮细胞，促使新生血管的内皮细胞发生凋亡，而正常的视网膜血管内皮细胞免受损害[16]。PEDF对新生血管的作用与剂量密切相关，PEDF 的抗血管增生作用是在相对低浓度时实现的。Apte等[17]研究结果显示,PEDF在较低剂量(0.5～5 μg/mL)下抑制内皮细胞迁移和血管形成，高剂量的PEDF(25～50 μg/mL)刺激内皮细胞迁移，增强血管形成，并刺激内皮细胞的VEGF生成。PEDF作为一种细胞外神经营养因子还能通过上调Bcl-2的表达使神经元细胞免受DR状态下氧化应激的损害[18]。目前大量研究表明DR患者眼局部PEDF水平明显低于正常对照组，在PDR患者中表现更为突出，其在机体内的具体发生机制不明。体外细胞培养高葡萄糖可直接下调RPE细胞的PEDF表达。细胞培养及动物实验均证实外源性PEDF通过抗氧化特性可以保护AGEs损伤培养的周细胞，但糖尿病状态下体内的AGEs以及活性氧族(ROS)可抑制视网膜内PEDF mRNA的表达，导致PEDF水平下降，加重高糖环境下的氧化应激损伤，促进血管内皮细胞及周细胞损伤、BRB破坏以及新生血管形成。

VEGF与PEDF之间存在一种相互抑制的调节机制，一方面视网膜血管内皮细胞和 Müller 细胞的VEGF表达在PEDF作用下可被明显下调，且PEDF可以竞争VEGFR-2受体，抑制VEGF促血管渗漏与新生血管形成的作用；另一方面DR患者的高糖及缺血缺氧状态可通过多种途径诱导VEGF表达升高，高水平的VEGF又明显下调PEDF的表达。因此，VEGF与PEDF在视网膜组织内的平衡破坏是引发BRB破坏、新生血管形成的关键因素，是导致DR发生发展的重要原因。目前抗VEGF已成为治疗DR新生血管以及黄斑水肿的一个新热点，其目的即为抑制DR患者眼部过多的VEGF，以期恢复“血管生成开关”的稳定。

3 抗氧化系统与氧化应激产物失衡

人体的抗氧化防御系统由酶类与非酶类抗氧化剂共同构成。前者主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物歧化酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)；后者主要包括维生素、微量元素等。抗氧化物具有清除自由基、保护生物膜、阻断和防止自由基引发的氧化和过氧化反应的作用。机体在正常情况下正常代谢的化学反应都会产生一些自由基，它们归属于ROS与NOS两大系统。生理量的ROS不仅可以杀伤体内的细菌，促进前列腺素、胶原蛋白以及凝血酶原的合成，而且参与肝脏解毒以及细胞分裂的调节。然而当机体处于理化损伤与应激状态时体内会产生大量自由基，自由基与蛋白质、核酸和脂质等发生反应，形成各种有害产物。自由基与脂类发生反应的产物主要有丙二醛(MDA)、共轭二烯、丙烯醛等，其中MDA是最终分解产物，可以作为衡量机体内脂质过氧化的程度；自由基损伤蛋白质的终末产物为晚期蛋白质氧化产物(AOPP)，是反映蛋白氧化程度的敏感指标[19]。通过测定SOD、GSH-PX、CAT在组织中或血浆中的活性以及MDA、共轭二烯、AOPP等氧化应激产物的含量可反映DR患者机体抗氧化系统的能力以及氧化应激的程度。

高血糖状态下可以通过多条通路诱导体内氧化应激产物增加，多元醇途径(PP)、PKC途径、氨基己糖途径(HBP)和AGEs及其受体途径的激活均能影响线粒体呼吸链及还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的氧化过程，使细胞自由基大量生成的同时也抑制了体内抗氧化系统的功能，导致抗氧化酶糖基化、活性降低。由于线粒体超氧化产生的大量自由基将激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，PARP影响磷酸甘油醛脱氢酶活性，导致正常的糖酵解途径受到抑制，从而促发PP、PKC途径、HBP和AGEs等异常代谢途径，形成恶性循环链。氧化应激状态是糖尿病慢性并发症发生发展的一个共同因素，长期高血糖引起眼部组织的氧化应激状态致使视网膜血管内皮细胞损伤、血管周细胞丢失、基底膜变厚以及视网膜神经细胞损伤。高血糖状态下葡萄糖的自发氧化、AGEs的大量生成、抗氧化酶活性降低以及PKC途径激活NADPH氧化酶等均为线粒体呼吸链上超氧化物过度表达的结果。研究表明DM及DR患者血清中抗氧化物的水平显著降低，而氧化应激产物明显升高[19]。1、2型糖尿病患者的晚期蛋白质氧化产物与正常对照组比较升高显著，在合并有微血管并发症的DM患者血清中升高更为明显[20]。DR患者存在严重的脂质过氧化损伤，其体内的MDA含量也明显高于无视网膜病变的DM患者。可见，氧化应激损伤以及抗氧化能力下降在DR的发生发展过程中起着重要的作用。

综上，视网膜内环境诸多平衡系统的破坏在DR发生过程中具有十分重要的作用，恢复视网膜内环境动态平衡有望成为防治DR的有效方法。

[1] 黎晓新，赵家良.视网膜[M].天津：天津科技翻译出版公司，2011:85-100.

[2] Evans T, Xi Deng D, Mukherijee K, et al. Endothelins, their receptors, and retinal vascular dysfunction in galactose-fed rats[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2000,48(2):75-85.

[3] Evans T, Deng DX, Chen S, et al. Endothelin receptor blockade prevents augmented extracellular matrix component mRNA expression and capillary basement membrane thickening in the retina of diabetic and galactose-fed rats[J].Diabetes, 2000,49(4):662-666.

[4]Toda N, Nakanishi-Toda M. Nitric oxide：ocular blood flow, glaucoma and diabetic retinopathy [J]. Prog Retin Eye Res, 2007,26(3):205-238.

[5] Pitocco D, Di Stasio E, Romitelli F, et al. Hypouricemia to an overproduction of nitric oxide is an early marker of oxidative stress in female subjects with type 1 diabetes[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2008,24(4):318-323.

[6] Yuan Z, Feng W, Hong J, et al. p38MAPK and ERK promote nitric oxide production in cultured human retinal pigmented epithelial cells induced by high concentration glucose [J]. Nitric Oxide, 2009,20(1):9-15.

[7] Leal EC, Manivannan A, Hosoya K, et al. Inducible nitric oxide synthase isoform is a key mediator of leukostasis and blood-retinal barrier breakdown in diabetic retinopathy [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2007,48(11):5257-5265.

[8] Goto R, Doi M, Ma N, et al. Contribution of nitric oxide-producing cells in normal and diabetic rat retina[J]. Jpn J Ophthalmol, 2005,49(5):363-370.

[9] Gupta N, Mansoor S, Sharma A, et al. Diabetic Retinopathy and VEGF[J]. Open Ophthalmol J, 2013,7:4-10.

[10] Ellis LM, Hicklin DJ. VEGF-targeted therapy: mechanisms of anti-tumor activity[J]. Nat Rev Cancer, 2008,8(8):579-591.

[11] Yamagishi S, Matsui T, Nakamura K, et al. Pigment-epithelium-derived factor (PEDF) inhibits angiotensin-II-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in MOLT-3 T cells through anti-oxidative properties[J]. Microvasc Res, 2006,71(3):222-226.

[12] Zheng Z, Chen H, Zhao H，et al. Inhibition of JAK2/STAT3-mediated VEGF upregulation under high glucose conditions by PEDF through a mitochondrial ROS pathway in vitro [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2010,51(1):64-71.

[13] Qaum T,Xu Q,Joussen AM, et al. VEGF-initiated blood-retinal barrier breakdown in early diabetes[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001,42(10):2408-2413.

[14] Joussen AM, Murata T, Tsujikawa A, et al. Leukocyte-mediated endothelial cell injury and death in the diabetic retina[J]. Am J Pathol, 2001,158(1):147-152.

[15] Tombran-Tink J, Johnson LV. Neuronal differentiation of retinoblastoma cells induced by medium conditioned by human RPE cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 1989,30(8):1700-1707.

[16] Stellmach V, Crawford SE, Zhou W，et al. Prevention of ischemiainduced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic agent pigment epithelium-derived factor[J].Proc Natl Acad Sci USA ,2001,98(5):2593-2597.

[17] Apte RS, Barreiro RA, Duh E,et al. Stimulation of neovascularization by the anti-angiogenic factor PEDF[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004,45(12):4491-4497.

[18] Elahy M, Baindur-Hudson S, Cruzat VF, et al. Mechanisms of PEDF retinopathy and neuropathy[J]. Endocrinol, 2014,222(3):R129-R139.

[19] 常东，潘洪志，许凤娟，等.糖尿病及其视网膜病变患者抗氧化酶及氧化应激产物的变化[J].哈尔滨医科大学学报,2008,42(5)：475-477.

[20] Martin-Gallán P, Carrascosa A, Gussinyé M, et al. Biomarkers of diabetes-associated oxidative stress and antioxidant status in young diabetic patients with or without subclinical complications[J]. Free Radic Biol Med, 2003,34(12):1563-1574.

国家自然科学基金项目(81473735)。

谢学军(E-mail:xxj8848@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.035

R771.3

A

1002-266X(2017)17-0099-04

2016-11-23)