心肌肥厚大鼠心肌细胞KATP对开放剂敏感性的变化

吕南英，张昊，罗逍，范茁

(华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006)

·基础研究·

心肌肥厚大鼠心肌细胞KATP对开放剂敏感性的变化

吕南英，张昊，罗逍，范茁

(华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006)

目的 探讨ATP敏感性钾通道(KATP)在异丙肾上腺素(Iso)诱导的心肌肥厚中对开放剂敏感性的变化。方法 急性分离SD大鼠心肌细胞，随机分为正常组、肥大组。正常组继续培养24 h，不做其他干预；肥大组以5 μmol/L的Iso处理24 h，成功诱导了心肌肥大模型。采用全细胞膜片钳记录两组开放剂吡那地尔诱发的心肌细胞膜KATP(sarcKATP)电流密度，采用激光共聚焦显微镜记录两组开放剂二氮嗪诱发的心肌细胞线粒体黄素荧光蛋白的荧光强度间接检测线粒体KATP(mitoKATP)敏感性变化。结果 正常组心肌细胞和肥大组心肌细胞sarcKATP的电流密度分别为(2.98±0.35)、(6.32±1.00)pA/pF，线粒体黄素荧光蛋白的荧光强度分别为(40.10±2.26)%、(21.88±0.17)%；两组比较差异均有统计学意义(P均< 0.05)。结论 心肌肥厚时sarcKATP对吡那地尔的敏感性增强，mitoKATP对二氮嗪敏感性减弱。

心肌细胞；心肌肥厚；ATP敏感性钾通道；大鼠

ATP敏感性钾通道(KATP)按其分布的部位分为两类：分布于细胞膜上的KATP (sarcKATP)和分布于线粒体膜的KATP (mitoKATP)。KATP受细胞内ATP浓度调节，当ATP浓度下降时通道开放，反之通道开放被抑制。研究表明KATP的开放是应对缺血、缺氧、心肌肥厚等各种代谢状态改变压力下的内源性保护机制。sarcKATP和mitoKATP通过不同的机制参与缺血再灌注损伤的心肌保护作用[1]；mitoKATP的开放剂二氮嗪能够抑制大鼠心肌细胞去氧肾上腺素引起的心肌肥厚[2]；离心型心肌肥厚sarcKATP对开放剂克罗卡林的敏感性降低[3]以及心肌肥厚代谢压力下KATP的活化受损[4]。2016年3～11月本研究利用膜片钳全细胞模式记录sarcKATP电流、激光共聚焦显微镜记录线粒体黄素荧光蛋白的荧光强度，分别观察肥大心肌细胞sarcKATP和mitoKATP对吡那地尔和二氮嗪的敏感性。

1 材料与方法

1.1 主要材料 酶Ⅰ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型胶原酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、50 μmol/L CaCl2。酶Ⅱ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型胶原酶、0.1 mg/mL蛋白酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、200 μmol/L CaCl2。酶Ⅲ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型胶原酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、600 μmol/L CaCl2。Buffer B：Tyrodes、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、1 mmol/L CaCl2。KATP外液：NaCl 137 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、CaCl21 mmol/L、NaH2PO41.2 mmol/L、HEPES 20 mmol/L、glucose 10 mmol/L。KATP外液中加入硝苯地平(10 μmol/L) 和色原烷醇B(10 μmol/L)分别阻断钙电流和内向整流钾电流，用NaOH调节pH至7.30～7.40。KATP内液：KCl 140 mmol/L，MgCl22 mmol/L，CaCl21 mmol/L，EGTA 11 mmol/L，Na2ATP 1 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，用KOH调节pH至7.20。另有异丙肾上腺素(Iso)、戊巴比妥钠、肝素、吡那地尔、二氮嗪(Sigma，美国)、二硝基苯酚(Sigma，美国)等。

1.2 心肌细胞急性分离及心肌肥厚细胞模型制作 取大鼠26只，用5%的戊巴比妥钠、肝素(1000 U/kg)腹腔注射后，以75%的乙醇对胸部皮肤进行消毒。迅速开腔取出心脏放在4 ℃预冷的无钙台式液冲洗后将心脏主动脉插于灌流装置上并逆行灌流无钙台式液体3～5 min，改用酶Ⅰ消化2 min，再改用酶Ⅱ循环消化25 min左右，待心脏变软时于酶Ⅲ中剪碎，于37 ℃水浴锅震荡消化3 min，再于200目金属筛网过滤，细胞滤液500 r/min离心1 min，所得细胞置于bufferB中沉降。在用层粘连蛋白处理过的培养皿中加入分离的大鼠心肌细胞和M199培养基，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养1 h，待细胞贴壁后随机分为正常组和肥大组。正常组继续培养24 h，不做其他干预。肥大组以5 μmol/L的Iso处理24 h，检测心肌细胞面积以及膜电容显著增大，ANP、BNP mRNA表达显著升高，与正常组比较有统计学差异，表明成功建立心肌肥厚细胞模型。

1.3 细胞sarcKATP对开放剂吡那地尔的敏感性检测 在全细胞记录模式下，用膜片钳放大器(HEKA，Lambrecht，德国)记录KATP电流，采样频率为10 kHz。贴有心肌细胞的玻片放于倒置显微镜(Nikon，日本)载物台上的浴槽中，玻璃微电极用电极拉制仪(Sutter，Novato，CA)分五步拉制，电极电阻为2～5 MΩ，浴槽中加入1 mL KATP细胞外液。KATP的刺激程序为：钳制电压为-40 mV，刺激脉冲电压为0 mV，持续时间均为500 ms，每隔30 s记录一次由KATP开放剂吡那地尔(100 μmol/L)诱发的sarcKATP电流密度。

1.4 细胞mitoKATP对开放剂二氮嗪的敏感性检测 mitoKATP开放会引起由质子泵维持的线粒体膜电位降低，加速呼吸链的电子传递从而引起线粒体氧化。线粒体的氧化还原状态间接通过线粒体内的黄素荧光蛋白的荧光值来表示[5]。暴露在二硝基苯酚的线粒体会引起ATP合成呼吸链解偶联，线粒体电势消失，导致线粒体的最大氧化。因此二氮嗪作用肥大细胞后，mitoKATP变化后线粒体内的黄素荧光蛋白荧光强度以二硝基苯酚的荧光值的百分数表示[6]。以二氮嗪(300 μmol/L)孵育肥大心肌细胞15 min，激光共聚焦显微镜(ZEISS,德国)拍摄黄素荧光成像，测定线粒体内黄素荧光蛋白荧光值。最大激发波长为488 nm，最大接收波长为530 nm。用时间序列模式每隔10 s扫描一次，实验温度为37 ℃，二氧化碳浓度为3%。

2 结果

2.1 心肌肥厚时sarcKATP对吡那地尔的敏感性变化 正常组心肌细胞和肥大组心肌细胞sarcKATP没有开放剂时都不开放。灌流KATP开放剂吡那地尔(100 μmol/L)后诱发出了sarcKATP电流。正常组、肥大组的sarcKATP电流密度分别为(2.98 ± 0.35)、(6.32± 1.00)pA/pF，肥大组的sarcKATP电流密度较正常组升高(P<0.05)。

2.2 心肌肥厚时mitoKATP对二氮嗪的敏感性变化 正常细胞和肥大心肌细胞mitoKATP在没有开放剂时都不开放。灌流KATP开放剂二氮嗪(300 μmol/L)后，正常组心肌细胞和肥大组心肌细胞黄素荧光蛋白荧光强度分别为(40.10±2.26)%、(21.88±0.17)%，肥大组黄素荧光蛋白荧光强度较正常组降低(P<0.05)。

3 讨论

心肌肥厚是心肌应对各种刺激的一种适应性反应，心肌肥厚导致的心率失常和心肌重构是心肌肥厚致死的重要因素。很多研究表明，心肌肥厚过程中钾离子通道的活动是引起电生理重塑和心率失常的最重要的因素。KATP是一种内向整流式钾通道，主要受ATP浓度调节，在生理条件下细胞内ATP的浓度为3～4 mmol/L，KATP处于基本关闭的状态，当细胞缺血等病理状态下细胞内ATP的浓度低于0.2 mmol/L时，sarcKATP会开放从而产生心肌保护作用[7]。近年来研究表明，KATP开放剂在许多动物品种上证明起到非常重要的心脏保护作用，KATP开放剂广泛应用于心率失常、心肌缺血、心肌肥厚等各个领域。KATP开放剂吡那地尔可能通过p70S6激酶依赖性的信号通路缓解心肌肥厚[8]；二氮嗪通过开放mitoKATP对去氧肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚具有保护作用[2]。心肌肥厚时KATP的开放起到了重要的心肌保护作用，因此，进一步研究心肌肥厚中KATP的特性以及潜在的机制具有重要的意义。

本研究发现，正常细胞和肥大心肌细胞sarcKATP和mitoKATP在没有相应开放剂时不开放，当灌流吡那地尔(100 μmol/L)时，sarcKATP打开，心肌肥大组的IKATP电流密度显著性升高，说明肥大心肌细胞sarcKATP对开放剂吡那地尔的敏感性增强；当二氮嗪(300 μmol/L)孵育15 min后，mitoKATP开放，心肌肥大组的二氮嗪诱发黄素荧光蛋白的荧光强度显著性降低，说明肥大心肌细胞对二氮嗪的敏感性减弱。

研究表明，蛋白激酶C(PKC)可能通过降低通道对ATP抑制位点的敏感性增加sarcKATP活性，蛋白激酶AC(PKA)可能通过降钙素相关基因肽、腺苷、环前列腺素和β肾上腺受体激动剂调节sarcKATP活性[9]。心肌肥大时sarcKATP对开放剂的敏感性增强，这可能是与心肌肥大时PKA、PKC的激活有关。Alvin等[3]研究表明体积超载所致的离心型心肌肥厚降低了sarcKATP对开放剂克罗卡林的敏感性，而本研究采用Iso通过β-AR系统诱导心肌肥厚，肥大心肌细胞sarcKATP对开放剂吡那地尔的敏感性增强，这可能与肥大细胞类型不同有关。一氧化氮(NO)供体能够通过cGMP信号通路增强mitoKATP开放剂二氮嗪的作用，且PKC活性对二氮嗪开放mitoKATP没有影响，代谢抑制时mitoKATP对阻断剂5-HD的敏感性降低[10]。cGMP是心血管系统生理和病理进程中的一个重要调节器，生理条件下心肌细胞cGMP主要来源NO激活的可溶性鸟苷酸环化酶，心肌细胞cGMP主要由蛋白激酶G(PKG)调节，研究表明cGMP信号通路在各种心血管疾病中受抑制。mitoKATP对二氮嗪的敏感性降低可能是心肌肥厚时cGMP受抑制导致的。

综上所述，心肌肥厚时，sarcKATP对吡那地尔的敏感性增强，其机制可能与心肌肥厚时PKA/PKC信号通路激活有关。心肌肥厚时，mitoKATP对二氮嗪的敏感性降低，其机制可能与心肌肥厚时PKG信号通路受抑制有关。

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国家自然科学基金资助项目(31300940)，中央高校基本科研业务费(2015ZM165)。

范茁(E-mail: fanzhuo@scut.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.009

R542.2

A

1002-266X(2017)17-0028-03

2016-12-03)