我国杨树黑斑病研究进展

2017-04-05范学恒辽宁省黑山县林业局辽宁锦州121400

防护林科技 2017年6期

范学恒(辽宁省黑山县林业局，辽宁锦州 121400 )

我国杨树黑斑病研究进展

范学恒
(辽宁省黑山县林业局，辽宁锦州 121400 )

杨树黑斑病是一种危害较重的杨树病害，受害杨树光合速率下降并提前落叶，影响树木的生长和营养储备。我国学者对杨树黑斑病开展了大量研究工作，在病原菌种类期专化型、寄主抗病性、植物-病原菌互作、分子生物学等方面成果显著，本文就我国在杨树黑斑病取得的相关进展进行了综述，并对存在问题进行简要分析。

杨树；杨树黑斑病；杨生褐盘二孢菌

杨树黑斑病又称杨树褐斑病，是一种危害较重的杨树叶部病害，能危害包括黑杨派、青杨派、白杨派及多种派间杂种杨树的幼苗、幼树及成年树[1]，其中中林46等速生杨树品种受害较重[2]。杨树黑斑病分布于整个杨树栽培区，在我国主要分布于吉林、辽宁、河北、河南、安徽、湖北、江苏、云南，新疆等地[3]。受害杨树光合效率下降并提早落叶，影响树木生长和营养储备[4]，造成杨树年生长量减少25%～50%，年平均木材产量损失约30%[1]。

1 病原菌分类及专化型

杨树黑斑病属真菌性病害，曾有报道认为引起杨树黑斑病的Marssonina属真菌有十几种[5]，Spiers根据分生孢子形态大小和分隔位置将欧洲和美洲286个杨树黑斑病标本归纳为4个种2个专化型[6]，在我国引起杨树黑斑病的病原真菌有3种，分别是白杨盘二孢菌(Marssoninacastagnei)、杨盘二孢菌(M.populi)和杨生褐盘二孢菌(M.brunneaf.sp.multigermtubi)。不同的病原菌引起的黑斑病症状在病斑位置、病斑形状等方面不尽相同：杨盘二孢菌引起的黑斑病病斑呈圆形，中间为乳白色胶状分生孢子堆，老叶上的病斑开始为黑褐色，以后病斑连接而后枯死。杨生褐盘二孢菌引起的黑斑病，先从叶背面产生针刺状亮点，后扩大成黑色，中间产生乳白色分生孢子堆，病斑多时，相互连接成不规则的斑块，使全叶变黑落叶。白杨盘二孢菌引起的杨树黑斑病，在叶正面上形成近圆形的、暗褐色病斑。空气潮湿时在病斑上产生一至多个乳白色小点，病斑数量多时连成不规则斑块。

杨生褐盘二孢菌(M.brunnea)是引起杨树黑斑病的主要致病病原，属半知菌亚门(Deuteromycotina)、腔孢纲(Coelomycetes)、黑盘菌目(Melanconiales)、盘二孢属(Marssonina)。在欧洲、美洲、大洋洲以及亚洲都有发现[7]，我国的杨生褐盘二孢菌，存在2种专化型[8-9]，依据对杨属不同派别致病力不同及分生孢子萌发时产生的芽管数量不同划分为单芽管专化型(M.brunneaf.sp.monogermtubi)和多芽管专化型(M.brunneaf.sp.multigermtubi)[5]。单芽管专化型，分生孢子萌发时产生一个芽管，在自然条件下以侵染白杨派树种及其杂交种为主，对黑杨派及青杨派树种致病性较低，在PDA培养基上其菌落颜色为深褐色，产生酱红色的孢子堆。多芽管专化型分生孢子萌发时产生1～5个(通产2～3个)芽管，在自然条件下以侵染黑杨派树种及其派内杂交种和黑杨派同青杨派的杂交种为主，在PDA培养基上其菌落颜色为浅白色或浅褐色，产生黄绿色的孢子堆。两个专化型菌株之间不能发生菌丝融合，为两个独立的遗传群体[5]。

韩正敏对我国江苏、河南、山东、陕西、北京和吉林6个省区的不同杨树上42个杨生褐盘二孢菌标本的分生孢子大小和形态、培养形状、致病性方面的差异进行了比较和分析，两个专化型在分生孢子大小及形态方面无显著差异，但在培养特性及致病性方面存在较大不同。各菌株分生孢子均为倒卵形，双细胞，两细胞不等大，直或稍弯曲。菌株间分生孢子的长度、宽度和分隔位置不明显，菌株间分生孢子大小和形态与菌株的地区来源和寄生来源均无明显相关性[5]。

另外谭碧玥[10]利用芽管萌发技术观察了M.brunnea分生孢子萌发过程中的有丝分裂过程，M.brunnea有丝分裂过程可以分为4个时期：前期染色质逐渐浓缩变短，中期可清楚观察得到3条染色体，后期姐妹染色单体发生分离并分别向两极移动，末期则可见子核的形成。同时确定Giemsa(吉姆萨染色)最适用于M.brunnea染色体观察。

2 寄主抗性研究

贺伟、杨俊秀等人对白杨派、青杨派、黑杨派不同种源和不同无性系杨树进行抗杨树黑斑病测试，结果表明杨树不同品系对黑斑病的抗性存在很大的差异。

贺伟[8]对3种杨树黑斑病病菌的寄主范围进行了细致研究，结合室内人工接种和田间自然发病调查结果，发现杨生褐盘二孢菌多芽管专化型能够侵染供试的黑杨派、青杨派及两个派间的杂交种；白杨派的毛白杨、银白银则为免疫树种。单芽管专化型能侵染白杨派的山杨、毛白杨及胡杨派的胡杨，不侵染白杨派的银白杨、新疆杨和黑杨派、青杨派及其派间杂种。杨盘二孢菌侵染箭杆杨和小叶杨，不侵染214杨、加杨、青杨白杨派和胡杨派树种。白杨盘二孢菌侵染白杨派新疆杨、毛白杨、山杨和胡杨派的胡杨，不侵染银白杨及黑杨派和青杨派的树种。杨俊秀[11]对84K杨、新疆杨、河北杨、毛白杨14等7个白杨派优良无性系进行了抗黑斑病、叶枯病和锈病的抗性测定与评价，84K杨表现出高度抗性。高建社[12]应用统计分析方法研究了22个不同种源和300个不同无性系青杨幼树对杨树黑斑病的抗病性，筛选出大通种源的14号无性系可以作为抗黑斑病育种材料。倪杨等[13]对黑杨无性系苗期对叶部病害抗病性进行了研究，筛选出140-31、17-89、02号杨、N-179杨和北抗杨对黑斑病免疫。周永学等[14]对引进的59个欧洲黑杨无性系苗期感染黑斑病进行调查，其中无性系N34，N13，N15等10个无性系对黑斑病表现出高度抗性。向玉英[15]在20世纪80年代通过室内抗病测试和田间试验，筛选出抗黑斑病和干部溃疡病的中林-115、中林379和中林34。

3 杨树与黑斑病菌互作

研究寄主-病原物互作关系，有助于揭示寄主感病机制，揭示病害发生的规律。我国学者对杨树与黑斑病菌互作方面的研究主要集中在生理生化、超微结构变化及分子生物学等方面[16]。

杨生褐盘二孢菌在侵染杨树早期在叶片侵染位点会形成微小由胼胝体和木质素组成的乳突毛，侵染寄主之后释放毒素和细胞壁降解酶造成寄主产生坏死病斑[17]，杨生褐盘二孢菌，主要参与茉莉酸信号传导途径，在茉莉酸和水杨酸处理后，两个信号途径相互抑制，即水杨酸途径被激活的程度大，茉莉酸信号通路抑制明显，从而表现为对黑斑病菌感病[18]。

植物表面气孔密度和植物的蒸腾速率对病原真菌孢子的侵染成功率及孢子萌发有一定影响。但是黑杨派杨树无论是抗病品种还是感病品种气孔大小和密度与抗/感病性能毫无关系，而过氧化物酶明显升高，说明病原菌菌丝或孢子可能产生诱导抗性的物质[19]。病原菌激发子可以激发寄主体内植保素积累和一系列抗病防卫反应，从而抑制或减轻病害的发生。国内外学者对病原菌激发子作了不少研究，水稻白叶枯病菌[20]、瓜类刺盘孢菌[21]等农业病害病原菌研究较多，而林业上的研究较少。研究表明，杨盘二孢菌存在激发子物质，梁伟红从杨盘二孢菌中获得CFE和CME两种激发子物质，处理杨树后发现抗病杨树的酶活性变化较为明显，POD、PAL的活性增强，且随浓度的升高活性明显提高。寄主植物与病原菌互作的早期常发生氧化暴发现象，氧化暴发是植物被病原体感染，发生过敏反应时产生和积累大量活性氧的现象。活性氧在后期防卫事件和互作关系的确定具有重要作用[22]。梁伟红[23]对杨树与杨盘二孢菌激发子互作进程中活性氧的释放进行了研究，研究表明，抗病的I-72杨悬浮细胞活性氧的释放表现出了氧化暴发现象，感病的加杨悬浮细胞活性氧释放量一直处于较低水平。

随着电子显微镜技术在杨树叶锈病等多种病害上的成功应用，有关杨树与杨树黑斑病菌互作中的组织和细胞学研究逐渐开展起来。袁坤[16]利用扫描电镜与透射电镜对健康的“NL895”和感染黑斑病的加杨叶片进行了显微观察，发现未感染黑斑病病菌的叶片表皮细胞正常，可以清晰地看到气孔，感染黑斑病的叶片表皮肿胀，孢子浮在叶片表面，且局部能看到菌丝体围绕在气孔周围，初步推测菌丝体可能直接从气孔侵入。杨树黑斑病菌侵染杨树叶片后导致叶肉细胞受损，细胞壁、叶绿体、线粒体、细胞核等超微结构发生变化，膜系统被破坏，同时细胞内嗜锇颗粒增大、数量增多，细胞的能量代谢受到干扰，正常生理活动受到影响。

4 分子生物学研究进展

随着杨树全基因组测序及杨生褐盘二孢菌全基因组测序工作的完成[24]，利用分子生物学手段研究病原菌的致病机制以及杨树抗黑斑病机制提供了新的思路，我国南京林业大学专家、学者在杨树抗黑斑病分子标记、抗病基因筛选、基因表达分析等方面做出了突出贡献。

张博[17]基于双拟测交策略构建了美洲黑杨I-69×欧美杨I-45杨F1群体分子标记遗传连锁图谱。母本I-69杨图谱包括206个AFLP标记、164个SSR标记、83个RAPD标记、6个ISSR标记、2个SNP标记和1个性别分化标记。父本I-45杨图谱包括153个SSR标记、142个AFLP标记、61个RAPD标记、10个ISSR标记和1个性别分化标记。同时采用分池法，分离出两个和抗杨盘二孢菌紧密连锁的RAPD分子标记。张燕梅[25-26]将与美洲黑杨抗黑斑病基因连锁的RAPD标记OPAI17-1550、OPAI13-900转化成显性SCAR(序列特异性扩增区域)标记(SAI17-1)和共显性SCAR标记(SAI13-2)。

在美洲黑杨×欧美杨F1代遗传图谱中，共检测到3个达到显著水平的杨树黑斑病QTL位点，MBD1、MBD2、MBD3，分别位于杨树同源连锁群Ⅱ、Ⅳ和ⅩⅨ。其中位于连锁群Ⅳ和ⅩⅨ的位点分别与毛果杨×美洲黑杨定位的杨树抗锈病基因位点位于同源连锁群上，说明杨树抗黑斑病机理于抗锈病的抗病机理可能存在相似之处。在3个位点所在的基因组区域都筛选到了与抗黑斑病相关的候选基因，且候选基因存在聚集分布现象。利用实时定量RT-PCR分析QTLs目标区段候选基因在黑斑病病原诱导下的表达情况，一个AP2类型转录因子在抗病植株中表达上调，而感病植物中没有明显变化[17]。

曾燕如[4]利用荧光差异显示反转录聚合酶链式反应(DDRT-PCR)，从杨树黑斑病的感抗无性系中分离出12个与抗病相关的cDNA片段，这些片段与病原菌识别、超敏反应体系表达基因、系统获得抗性和细胞保护机制等有关，并在此基础上构建了感抗无性系的cDNA文库，为杨树黑斑病抗病机理的研究奠定了一定的基础。张新叶[27]利用EST技术从构建好的2个杨树感抗黑斑病叶片cDNA文库中随机挑取克隆进行测序，获得21 657条EST序列，其中UniGene10 816个，含量较高的、有功能的基因主要是杨树叶片组织特异性相关基因和杨树叶片受外界胁迫表达的抗逆相关基因。对8 853个被注释的基因中，担负生物生理过程功能的基因最多，达5 350个。同时根据功能注释结果挑选3 000个与抗病及其他功能相关的克隆制备了cDNA芯片。

张燕梅[18]利用基因芯片技术从转录组水平研究杨树在受杨生褐盘二孢菌处理后基因表达变化情况，在病原菌处理过程中1 160个基因被不同程度的诱导，这些基因分属于11个功能类别，其中42%集中在参与新陈代谢、防御反应、信号传导及转录调控的基因。同时1 160个差异表达基因中80%被定位在19条连锁群上，基因在染色体上末端区域大量聚集，中间区段较少且排列稀疏，此种分布情况是否与植物抗病有关系有待于进一步的研究。

杨树在受杨盘二孢菌侵染早期，杨树叶片中抗坏血酸过氧化物酶(APX)和S- 腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)在mRNA水平上均差异表达并且表达量降低，说明两个酶在与杨树抗病过程是密切相关的，可能在杨树防御应答中发挥重要作用[28]。蛋白质水平上，杨生褐盘二孢菌侵染后杨树有40个差异表达的蛋白点，包括与光合成、蛋白合成、能量代谢、防御应答相关蛋白等，这些蛋白多数在病原胁迫下表达下调[29]。曹友志[7]利用蛋白质双向电泳技术从培养基中分离杨生褐盘二孢菌分泌蛋白，并利用MS-BLAST鉴定出其中的四个蛋白，有三个是细胞膜降解酶，一个是病原激发子蛋白。

效应因子具有干扰植物病原相关分子模式诱发性免疫及相关级联反应的功能，是研究植物与病原菌间相互作用的重要部分[24]。曹友志[24]等根据杨生褐盘二孢菌测序信息和植物病原菌效应因子的特点，预测出106个候选效应因子，并成功克隆25个。利用杨树原生质体瞬时表达系统鉴定出4个效应因子蛋白可以抑制杨树转录因子WRKY29启动子的活性，可能会影响到病原微生物侵染信号在植物细胞内的传导，进而干扰植物免疫系统。

另外以前被人们忽视的小分子物质在生命活动中发挥了重要的作用，杨生褐盘二孢菌在侵染南林895杨后，miRNA156a和miRNA164a的表达水平均受到明显抑制，可能参与了南林895杨抵抗病原菌侵染的过程[30]。

5 其他方面

除了病原菌分类、寄主抗病性、抗病机制以及分子生物学方面的研究之外，我国的研究学者对杨树黑斑病的预测预报、空间分布型、综合防治等方面也有研究。

杨树黑斑病的流行受温度、降雨量和相对湿度等气候条件的影响，各地区因气候条件差异病害流行规律也不尽相同。东北地区杨树黑斑病一般7月上旬开始发生，7月下旬至8月上旬为发病高峰[31]。北京地区白杨派黑斑病5月初即可发生，7—8月达到高峰，黑杨派、青杨派及其派间、派内的杂交种7月中旬开始发生，8月上旬为高峰期，9月末基本停止[32]。而南京地区毛白杨、响叶杨黑斑病4月初开始发病，5月发病最重，7—9月基本停止发展[33]。

薛煜建立了中国东北地区杨树黑斑病的短期预报模型及生长损失率的估测模型，对东北地区黑斑病的防治起到了一定的作用[34]。吴佳徽[1]等运用数量化理论Ⅰ建立了北京郊区杨树黑斑病数量化预测模型,对测报模型检验的预测精度在88.49%～96.43%之间，发现杨树黑斑病菌孢子的飞散量受温度、湿度和降雨量影响与气象因子的关系呈多峰曲线。祝继强等[35]通过计算聚集性指数和聚集性指标分析得出杨树黑斑病病斑的空间分布型表现为杨树树冠叶片上成聚集分布，杨树黑斑病空间分布型为聚集分布，但接近随机分布。

对黑斑病的防治，人工扫尽树下落叶并集中烧毁是减轻病原的主要措施。适地适树，营造混交林，合理密植，改善通风透光条件等营林措施是预防病害发生的必要措施[3]。药剂防治在发病初期和发病盛期用烟雾机交替施用2.5%氟硅唑和8%百菌清热雾剂4次，相隔10 d，防治效果为65.79%，推迟病树落叶20 d左右[2-3]。

[1] 吴佳徽,李铮,周在豹,等.杨树黑斑病测报模型的研究[J].中国森林病虫，2012,31(1)：5-8

[2] 郭瑞,祁建华,秦志强,等.应用6HYB-25B型烟雾机防治杨树黑斑病试验[J].中国森林病虫,2009,28(5):36-37,46

[3] 国家林业森林病虫害防治总站.林业有害生物防治历一[M].北京:中国林业出版社,2010:42-43

[4] 曾燕如,黄敏仁,王明麻.杨树黑斑病感抗无性系cDNA文库的构建[J].南京林业大学学报:自然科学版,2004,28(3):83-85

[5] 韩正敏,李传道,黄敏仁.我国杨生褐盘二孢菌菌株比较[J].林业科学,1998,34(3):59-65

[6] Spiers A G.Comparative studies of type and herbarium specimens of Marssonina species pathogenic to poplars.Europ.J.For.pathol,1988,18(3-4)：140-156

[7] 曹友志.杨树黑斑病病原-杨生褐盘二孢菌分泌蛋白及效应因子研究[D].南京：南京林业大学,2012

[8] 贺伟,杨旺.三种杨树黑斑病菌的寄主范围及在我国部分地区的分布[J].林业科学,1991,27(5):560-564

[9] 李传道.杨盘单隔孢菌(Marssoninapopuli)的两个专化型[J].南京林学院学报,1984,8(4):10-16

[10] 谭碧玥,曹友志,徐立安,等.杨树黑斑病菌M.brunnea的有丝分裂过程和染色体数观察[J].南京林业大学学报,2012,36(1):21-27

[11] 杨俊秀,高健壮,周永学.白杨派几个无性系抗病性的测定与评价[J].西北林学院学报,2005,20(1):41-42

[12] 高建社,樊军锋,周永学,等.不同种源青杨幼树抗锈病、黑斑病的研究[J].西北林学院学报,2004,19(3):24-25,27

[13] 倪杨,陈敏,郭利民,等.黑杨无性系苗期生长性能和叶部病害抗病性研究[J].安徽农业科学,2010,38(12)：6519-6521,6596

[14] 周永学,樊军锋,高建社,等.欧洲黑杨无性系苗期抗病性测定[J].西北林学院学报,2005,20(1):43-45

[15] 向玉英,朱湘渝,侯艳.杨树新品种抗溃疡病和黑斑病的研究[J].林业科学研究,1992,5(4)：423-428

[16] 袁坤,于芬,王明麻,等.黑斑病菌侵染后杨树叶片细胞超微结构的变化[J].中国农学通报,2009,2(24):163-166

[17] 张博.杨树比较作图及重要形状QTLs定位[D].南京：南京林业大学，2005

[18] 张燕梅.杨盘二孢菌诱导的杨树差异表达基因的功能分析和染色体定位[D].南京:南京林业大学,2007