鸡大肠杆菌的分离鉴定及自家灭活苗在生产中的应用

2017-04-05王彩霞山东畜牧兽医职业学院山东潍坊261061

山东畜牧兽医 2017年9期

王彩霞（山东畜牧兽医职业学院山东潍坊 261061）

王彩霞（山东畜牧兽医职业学院山东潍坊 261061）

鸡病是由病原性大肠杆菌引起的鸡的局部或全身性感染的总称。常见的病型有败血症、胚胎及和幼雏死亡、眼炎及肿头综合症、脐炎和肉芽肿。本病从鸡的胚胎期到产蛋期可发生，对养禽业危害很大，造成巨大的损失。大肠杆菌对很多抗菌药物有耐药性，通过分离到的大肠杆菌制备了自家灭活苗，结果显示自家灭活苗有很好的效果。

大肠杆菌属于肠杆菌科、埃希氏属，致病性的有败血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、产类志贺肠毒素大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌五大类，其中鸡败血性大肠杆菌危害最大。鸡群爆发大肠杆菌病时，常发生继发感染。大肠杆菌革兰氏染色阴性，无芽孢，除少数菌株外，一般无荚膜，最适宜生长pH7.2～7.4，在肉汤培养基中培养18～24h，呈均匀生长，管底有少量沉淀，液面与管壁形成菌膜，在营养琼脂培养基上形成圆形、隆起、半透明、湿润、无色或灰白色的菌落。

1 材料和方法

1.1 样品采集根据鸡群发病情临床症状及剖检变化，取新鲜病死鸡的肝脏。

1.2 分离细菌初次分离的大肠杆菌，用普通营养琼脂平板和麦康凯琼脂平板，划线接种，在37℃需氧培养12～18h后长出淡红色菌落。

1.3 形态学观察挑取圆形、隆起、半透明、湿润、无色或灰白色的菌落涂片进行革兰氏染色，镜检。

1.4 生化试验将分离的细菌分别作糖发酵试验、M-R试验、V-P试验、枸橼酸盐利用试验、吲哚试验、H2S试验、尿素分解试验和三糖铁琼脂试验，均在37℃恒温下培养，观察结果，逐一鉴定筛选。

1.5 纯化细菌挑选典型的菌落作纯培养，然后移植到普通营养肉汤培养基中，培养12～18h的培养物即为种子(一级种子)，再接种到普通营养肉汤培养基中的培养物为二级种子，……。使用一段时间后要复壮种子。

1.6 增菌培养取种子液接种于普通营养肉汤培养基或者马丁肉汤培养基中，接种量为培养基量的2%～4%。37℃培养10～14h或18～24h后呈现均匀浑浊。

1.7 测定菌数活菌计数大于等于100亿/ml培养基。

1.8 灭活活菌计数后，将增菌培养后的培养基中加入0.3-0.6%福尔马林，37℃培养24-48h，每隔2～4h摇振一次，无菌检验合格后备用。

1.9 加佐剂配苗（1）油相制备：10号白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，先取适量10号白油与硬脂酸铝混合，加热熔化后再与其余的10号白油和司本-80混合，115℃高压灭菌30min，冷却后备用。（2）水相制备：取灭活好的菌液96份，加入冷却后的吐温-80 4份，充分振摇，使其溶解。（3）菌苗乳化：先将油相和水相1:1加入胶体磨中，10000rpm高速搅拌5min，充分乳化制成油包水的乳剂疫苗，分装待检。（4）无菌检验：将油苗接种于硫乙醇酸盐培养基37℃培养48～96h，观察有无细菌和霉菌生长。

1.10 安全性检验 7～20日龄健康雏鸡10只，每只肌肉注射1ml或其它量，设对照组10只注射生理盐水，观察2天，记录有无不良反应，同时检查注射部位有无异常。

1.12 效力检验 7～20日龄健康雏鸡10只，每只肌肉注射1ml或其它量，设对照组10只注射生理盐水，20d后，用1～10亿个/只同型致病性大肠杆菌活菌混合液肌肉注射0.2ml，观察10d，免疫组中保护率80%以上判为合格。