接种AMF对煤矿废弃物上高丹草根系生长及抗氧化酶系统的影响

高雁琳++李钧敏++闫明

摘要：采用盆栽试验方法，以高丹草为研究对象，选用摩西球囊霉（Glomus mosseae）和地表球囊霉（Glomus versiforme），分别研究单接种和混合接种对粉煤灰（S1）、煤矸石（S2）和粉煤灰与煤矸石混合物（S3） 3种基质上高丹草（Sorghum bicolor×S.sudanense）根系形态及抗氧化酶系统的影响，并以正常沙土（S4）作为对照。结果表明：煤矿区废弃物基质上高丹草根系的生长受到抑制，接种AM真菌减缓了高丹草根系生长受抑制的程度，促进根长、根表面积、根体积、根生物量的显著增加；高丹草根系SOD、POD、CAT活性显著提高，MDA含量降低。AM真菌可通过调节高丹草根系形态，提高根系抗氧化酶活性，增强高丹草在煤矿废弃物复合逆境中的抗逆性，并且接种摩西球囊霉对粉煤灰以及[JP2]粉煤灰和煤矸石混合基质上高丹草根系的促进作用最佳，而接种地表球囊霉更适于煤矸石基质上高丹草根系的生长。

关键词：丛枝菌根真菌（AMF）；煤矿废弃物；高丹草；根系形态；抗氧化酶

中图分类号： X171.4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0452-05

收稿日期：2015-10-08

基金项目：国家自然科学基金（编号：30800133、31270461）；山西师范大学校基金（编号：ZR1211）。

作者简介：高雁琳 （1988—），女，山西朔州人，硕士，主要从事菌根生态学研究。E-mail：cgsayll@126.com。

通信作者：闫明，博士，副教授，硕士生导师，主要从事植被生态学研究。E-mail：mycorrhiiza@sina.com。

煤矿开采对环境造成极大扰动，引发了一系列亟待解决的生态环境问题，如水土流失、土地贫瘠化、盐碱化等。采煤沉陷区是煤矿废弃地复垦的主要类型之一，其治理也是目前矿区生态修复的重大难题。充填复垦是采煤沉陷区植被重建的主要方式之一，而煤矸石和粉煤灰是目前充填复垦的主要材料[1]，然而，其具有物理结构不良、保水保肥能力差、营养元素缺乏、重金属浓度高、盐分含量过高、极端pH值以及微生物区系稀少且活性极低等许多不利因子[2]，可引起植物生长及其生理活性的降低，最终导致植被退化，因此，增强煤矿废弃地植被抗逆性、提高植物成活率具有实际意义。丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）存在于幾乎所有类型的土壤中，可以与陆地上绝大部分的高等植物物种形成互惠共生体[3]，改善植物对水分和矿质营养的吸收，增强植物对高盐度及重金属等不利因子的耐性[4-5]，提高植物存活率，促进植物生长。

目前，煤矿区AM真菌的研究，一方面集中在对煤矿区AM真菌的调查、分类以及优势AM真菌的筛选[6-7]，另一方面集中在通过接种AM真菌对煤矿区土壤进行改良（如土壤肥力、土壤酶活性[8-9]等）以及对植物进行修复（如促进矿质营养的吸收[10-11]和对重金属的吸收与转移[12]等方面）。植物根系是吸收水分和养分并进行物质转化的重要器官，其生长发育及形态特征直接影响地上部的形态建成和物质积累，同时也是AM真菌侵染和最先感受煤矿废弃物不利因子复合胁迫信号的部位[13]。AM真菌如何影响煤矿废弃物在复合逆境中植物根系的形态及抗氧化酶系统，能否促进根系的生长、提高抗氧化酶的活性、增强植物的抗逆性，目前相关研究较少。因此，本研究以高丹草为试验材料，分析了单接种和混合接种AM真菌对不同类型煤矿区废弃物上高丹草根系形态、根系活力和抗氧化酶活性的影响，并进一步筛选出不同类型的煤矿废弃物上高丹草接种的最适AM菌种，以期为运用菌根技术提高煤矿区植被恢复效果提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

菌种摩西球囊霉（Glomus mosseae，BGC NM01A）和地表球囊霉（Glomus versiforme，BGC GD01C），由北京市农林科学院植物与营养资源研究所提供，接种剂为以高粱为宿主植物繁殖的土沙混合物，内含被感染根段、孢子和菌丝。高丹草[Sorghum bicolor （L.） Moench×Sorghum sudanense（Piper） Stapf，晋草1号] 种子由山西省临汾市小麦研究所提供。供试基质为煤矸石（取自山西省临汾市煤运公司煤炭转运站）、粉煤灰（取自山西省漳泽电力临汾热电公司）及土沙混合物（黄土和河沙体积比为3 ∶[KG-*3]1）。煤矸石过3 mm筛，黄土、河沙和粉煤灰过1 mm筛，经121 ℃高温高压蒸汽灭菌2 h，取出放置1周后备用。栽培容器为棕色圆形塑料花盆（盆口直径18 cm×盆底直径14 cm×盆高15 cm）。

1.2试验设计与处理

采用随机区组设计，设定2个因素：菌根和基质。菌根有4个水平：不接种对照（CK）、接种G.mosseae（G.m）、接种G.versiforme（G.v） 以及两者混合接种（G.mv）；基质有4个水平：粉煤灰、煤矸石、粉煤灰与煤矸石混合物（体积比为1 ∶[KG-*3]4） 以及沙土混合物（体积比为1 ∶[KG-*3]3） ，依次编号S1、S2、S3、S4，供试基质基本理化性质见表1。每个处理设4个重复，共计64盆。2014年6月2日挑选籽粒饱满、大小均一的种子，置于10% H2O2 中表面消毒10 min，无菌水冲洗5次，置于 25 ℃ 培养箱中的湿润纱布上催芽，种子露白即可播种。每盆装厚度约8 cm的灭菌基质，粉煤灰、煤矸石、粉煤灰与煤矸石混合物及沙土混合物的质量分别为1 405、1 785、1 598、2 250 g，其上覆盖灭菌沙土800 g，厚度约为3 cm，采用菌种层接法，分别称取接种剂G.m、G.v以及2种菌剂按1 ∶[KG-*3]1比例混合均匀后的接种剂各120 g，将60 g菌剂均匀撒施在土壤表面，放入已催芽的种子20粒，在其上覆盖60 g菌剂，再覆盖沙土220 g，厚度约为1 cm。不接种处理采用相同方法加入120 g的灭菌菌剂。

1.3测定参数和方法

2014年8月31日收苗，将整个植株连同花盆一起浸泡在水中，将植株从花盆中小心取出，洗净后，用WinRHIZO根系分析仪测定根表面积、根体积和根平均直径；用Phillips and Hayamn [14]方法进行染色，统计菌根侵染率；将收获的植株根系置于烘箱中，105 ℃烘干至恒重称质量，计算生物量。

采用TTC法测定根系活力；采用NBT法测定SOD活性；采用愈创木酚法测定POD活性；采用紫外吸收法测定CAT活性；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量[15]。

1.4统计分析

所有试验数据用SPSS 17.0进行平均值和标准误差的计算，并进行方差分析和邓肯多重比较。

2结果与分析

2.1接种AM真菌对高丹草根系菌根侵染率的影响

由图1可知，4种基质上3种接种处理均获得较高的菌根侵染率，且均存在显著性差异，未接种处理菌根侵染率极低。在基质S1、S3和S4上接种G.m处理菌根侵染率均为最高（P<0.05），分别为65.41%、68.59%、58.00%，接种G.v处理菌根侵染率均较低，分别为35.36%、39.44%、42.39%；而在S2基质上接种G.mv处理菌根侵染率显著高于其他2种接种处理，为67.14%，接种G.m和G.v处理间菌根侵染率差异不显著。接种G.m处理基质S1和S3间菌根侵染率差异不显著，基质S2和S4间无显著差异。接种G.v和G.mv处理基质S2上菌根侵染率显著高于其他基质，未接种处理4种基质间菌根侵染率无显著差异。

[FK（W13][TPGYL1.tif]

2.2[JP3]接种AM真菌对高丹草根系形态、生物量和根系活力的影响

4种基质上接种AM真菌显著增加了植物根系活力、根长、根表面积、根体积和根生物量，显著降低根平均直径（图2，P<0.05）。在基质S1上，3种接种处理间根体积差异不显著，接种G.v和G.mv处理间根长、根表面积、根生物量差异不显著，显著低于接种G.m处理。在基质S2上，接种G.v和G.mv处理间根长差异不显著，接种G.v处理根表面积、根体积和根生物量显著高于其他接种处理。在基质S3和S4上，接种G.m处理根长、根表面积、根体积和根生物量均显著高于其他接种处理；基质S4上接种G.v和G.mv处理间根长和根体积差异不显著。基质S1、S3和S4上接种G.v和G.mv处理间根平均直径差异不显著，但显著高于接种G.m处理；基质S2上3种接种处理间根平均直径无显著差异。在基质S1和S4上，接种G.m处理根系活力显著高于其他接种处理；在基质S2上，3种接种处理间根系活力差异不显著；在基质S3上[CM（25]接种G.m和G.mv处理间根系活力差异不显著，显著高于[CM）]

[FK（W30][TPGYL2.tif]

接种G.v处理。基质S4根平均直径显著高于其他3种基质，3种矿区废弃物基质中基质S3上高丹草其他各指标均高于基质S1和S2。

2.3接种AM真菌对高丹草根系抗氧化酶和MDA含量的影响

从图3可以看出，与未接种处理相比，接种AM真菌显著提高了SOD、POD、CAT活性，降低了MDA含量。基质S1、S2和S4上，接种G.v和G.mv处理间SOD、CAT活性差异不显著；基质S1和S4上，两者均显著低于接种G.m处理；在基质S2上两者均显著高于接种G.m处理。基质S1和S3上接种G.m处理POD活性显著高于其他接种处理，接种G.v处理显著低于其他接种处理（P<0.05）；在基质S2和S4上，接种G.v 和G.mv处理间POD活性差异不显著。基质S1上，接种G.m处理MDA含量显著低于其他接种处理；在基质S2上，3种接种处理间MDA含量差异不显著；在基质S3和S4上接种G.v和G.mv处理间MDA含量差异不显著，显著高于接种G.m 处理。3种矿区废弃物基质上高丹草SOD、POD、CAT活性以及MDA含量显著高于基质S4。基质S3上高丹草根系SOD、POD、CAT活性显著高于其他2种煤矿废弃物基质，MDA含量显著低于其他2种煤矿废弃物基质。

2.4高丹草根系抗氧化酶活性MDA含量与其他各指标相关性分析

由表2可知，菌根侵染率与根系活力、CAT活性呈极显著正相关，与根平均直径和MDA含量呈极显著负相关，与根体积、根生物量呈显著正相关，与根表面积、根长、SOD活性和POD活性呈正相关，但未达显著水平；SOD活性和POD活性与根平均直径均呈显著负相关，与其他根系参数呈正相关，未达显著水平；CAT活性与根系活力、根表面积和根体积呈显著正相关，与根长和根生物量呈正相关，未达显著水平；MDA含量与根平均直径呈正相关，未达显著水平，与其他各参数呈极显著负相关。

3讨论

本试验中，4种基质上3种接种处理均具有较高的菌根侵染率，表明AM真菌与高丹草建立了良好的共生关系。4种基质不同，菌根侵染率以及菌种间的相互作用有差异，这种差异可能是因为4种基质的pH值、营养成分和有机质含量以及基质类型等理化性质存在显著差异（表1），菌根侵染率及菌种间的相互作用受到基质类型、pH值、矿质营养和有机质含量等理化性质以及宿主植物等因素的综合影响。菌根与基质以及宿主植物之间存在一定的选择性，不同菌种对不同基[CM（25]质的适应和生存能力以及宿主植物的亲和力不同，从而造在土壤逆境胁迫条件下，植物最先感受逆境胁迫的器官是根系。重金属、盐碱以及养分缺乏等胁迫条件均会抑制植物根系生长[17-19]。本试验结果表明，煤矿废弃物基质上高丹草根系生长受到抑制，接种AM真菌顯著增加了根长、根表面积、根体积，提高了根系活力，从而影响根系生物量，这与张中锋等研究结果[18]以及相关性分析结果一致。表明在煤矿废弃物复合逆境中AM真菌可能通过一定的途径调整高丹草根系代谢途径和方向，改变碳同化产物的分配比例和方向，进而改变根系形态和分布，增加了高丹草根系与土壤的接触面积，促进了高丹草根系对水分和养分的吸收以及碳水化合物向根系的积累和分配，从而维持其功能行为，提高了高丹草对煤矿废弃物复合逆境胁迫的抗性。此外，AMF可诱导高丹草根系产生更多生长素，且AMF孢子自身含有的微量生长素也可转移到高丹草根系中，促进根系生长发育。在煤矿废弃物复合逆境中接种AM真菌高丹草根平均直径显著降低，相关性分析表明菌根侵染率与根平均直径呈极显著负相关，说明AM真菌可能诱导高丹草根系更细小，使其易从煤矿废弃物中吸收更多的水分和养分。一般认为，AM真菌对宿主植物侵染率越高，对促进植物生长的可能性也就越大[20]。本试验中基质S1、S3和S4均符合这一规律，这与赵仁鑫等的研究结果[2，21]一致；然而在基质S2上，混合接种处理对高丹草的侵染率较其他接种处理高，但对高丹草根系生长的促进效果反而低于接种G.v处理，这与Bi等的研究结果[22]相似。这表明菌根对宿主植物的作用不完全由侵染率决定，可能与由于煤矿废弃物基质类型、条件以及菌种的适应性不同，造成菌根共生关系中成本-收益不平衡有关。4种基质上高丹草根系生长表现为S4>S3>S2>S1，这与王辉等的研究结果[23]相似，说明与粉煤灰相比，高丹草更适合在煤矸石上生长，粉煤灰和煤矸石按一定比例混合可对粉煤灰和煤矸石的理化性质起到一定的改良作用。

研究表明，正常情况下，植物细胞内自由基的产生与清除处于动态平衡状态，逆境胁迫下（如重金属、盐碱以及养分缺乏等）该平衡受到破坏，导致植物体内活性氧、自由基大量积累，引发膜脂过氧化作用，细胞膜系统受损，膜脂过氧化产物MDA积累，对植物造成严重伤害[19]。本试验中，3种煤矿废弃物基质上高丹草根系中MDA含量显著高于正常基质，接种AM真菌显著降低了根系中MDA含量，这与谢翔宇等的研究结果[19，24]一致。表明煤矿废弃物复合逆境中高丹草根系活性氧含量增加，导致膜脂过氧化程度加剧，接种AMF可减缓该逆境下高丹草根系中膜脂过氧化程度，减轻细胞膜系统损伤。在逆境胁迫下，SOD、POD和CAT是植物的重要保护酶类。植物体内存在一个由SOD、POD和CAT等组成的活性氧自由基清除系统，正常环境下，SOD、POD、CAT及其他保护物质能够维持植物体内ROS的产生和清除处于动态平衡状态，从而降低ROS对植物细胞膜结构造成伤害的可能性[19]。本试验发现，3种煤矿废弃物基质上高丹草根系SOD、POD、CAT活性均高于正常基质，说明高丹草根系感受到煤矿废弃物基质不利因子的胁迫信号时，由于自身的应激能力，可通过提高根系抗氧化酶活性来适应煤矿废弃物的不良環境，郭绍霞等也发现了类似结果[25]。接种AM真菌显著提高了煤矿废弃物上高丹草根系中SOD、POD和CAT的活性，相关性分析结果证明了这一点。说明在煤矿废弃物复合逆境中接种AMF可能促进了3种酶在mRNA水平上的表达[26]，增加了高丹草根系抗氧化酶活性，增强了根系中自由基的清除能力，降低了MDA含量，从而减轻了煤矿废弃物不利因子对高丹草造成的膜伤害，增强其抗逆性。相关性分析显示，高丹草根长、根表面积、根体积和根生物量与根系抗氧化酶活性呈正相关关系，与MDA含量呈负相关，表明AM真菌可通过改善高丹草根系酶促反应系统，提高根系抗氧化酶活性，降低膜脂过氧化程度，来缓解煤矿废弃物不利因子对高丹草根系的复合胁迫，影响其根系生长发育，提高其对该复合逆境的抗逆性。

4 结论

3种煤矿废弃物基质上，高丹草根系生长受到抑制，根系形态指标和生物量显著降低，MDA含量增加，由于高丹草自身对煤矿废弃物基质不利因子的应激能力，根系抗氧化酶活性显著增加。AM真菌很好地侵染了高丹草根系，接种AM真菌显著提高了高丹草的根系活力，增加了根长、根表面积、根体积和根生物量，诱导高丹草根系保护酶（SOD、POD和CAT）活性提高，降低了膜脂过氧化产物MDA含量，从而缓解了煤矿废弃物基质的不利因子对根系造成的损伤，维持高丹草的正常生长，提高其在煤矿废弃物复合逆境中的抗逆性，并且接种G.m对粉煤灰以及粉煤灰和煤矸石混合基质上高丹草根系的促进作用最佳，而接种G.v更适于煤矸石基质上高丹草根系的生长。因此，在煤矿区废弃地生态恢复中，为更好地发挥菌根的作用，应针对不同类型煤矿废弃地接种不同的AM真菌，在一定程度上可解决矿区废弃地植被生长受胁迫和易退化等问题，提高植被恢复效果。

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