ABA对匍枝筋骨草防御酶活性及蜕皮激素合成的影响

杨月月+迟德富+宇佳

摘 要 向培养了7 d的匍枝筋骨草悬浮细胞培养体系内分别添加0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L的ABA，以研究ABA对匍枝筋骨草细胞防御系统的作用及ABA对蜕皮激素合成的影响.试验结果表明：向培养7 d的悬浮体系中，添加0.1～0.4 mg/L的ABA后，悬浮细胞第4天出现褐化；添加0.5 mg/L的ABA后，第3天出现悬浮细胞褐化现象；添加不同质量浓度的ABA后第4天测其悬浮细胞生长量均与对照差异不显著；添加不同质量浓度ABA后悬浮细胞的SOD，POD 和CAT活性在48 h内均显著上升，而PAL活性变化在2～24 h间不显著，后上升；添加不同质量浓度的ABA可使筋骨草悬浮细胞的蜕皮激素含量增高，而添加0.1 mg/L ABA，其蜕皮激素含量增高最为显著.

关键词 匍枝筋骨草；β-蜕皮甾酮；ABA；抗氧化酶

中图分类号 S567239 文献标识码 A 文章编号 1000-2537（2015）03-0016-06

筋骨草，唇形目（Lamiales）唇形科（Lamiaceae）筋骨草属（Ajuga）植物，一年或二年生草本，高10～30 cm，原产欧亚大陆[1]，我国南方地区主产.筋骨草的主要次生代谢物为脱皮甾酮、杯苋甾酮、筋骨草甾酮B和C、筋骨草糖、筋骨草内酯、黄酮甙、皂甙及生物碱等[2].国内外对匍枝筋骨草的研究主要集中在医药与昆虫方面.在医药上匍枝筋骨草具有清热解毒，凉血平肝的作用.用于治疗上呼吸道感染，扁桃体炎，支气管炎，咽炎，肺炎，胃肠炎，肝炎，阑尾炎，高血压等；外用可治跌打损伤，痈疖疮疡[3].在害虫控制方面，匍枝筋骨草蜕皮激素含量较高，提取的植物源蜕皮激素具有良好的杀虫效果[4]，可用于植物源杀虫剂和生长调节剂的制作，具有经济和环境保护的价值.

脱落酸（Abscisic Acid，ABA）是一类抑制生长，促进植物休眠的植物激素，又称S-诱抗素，也有“逆境激素”之称[5].将ABA加入细胞培养体系后，会介导植物细胞依次发生信号识别、信号转导等生理生化水平的变化[6]，在逆境条件下ABA含量增高，提高植物抗性.在体系中添加ABA，ABA含量也会增高.近年研究发现，逆境条件下ABA在植物细胞培养生产次生代谢物中具有调控作用，可以诱导绿原酸、酚类、黄酮类和萜类物质的增加[7].但ABA直接诱导细胞次生代谢产物却未见报道.

ABA是一种对人畜无害，新型高效，天然的植物生长活性物质.本文在匍枝筋骨草悬浮体系中研究ABA对匍枝筋骨草细胞防御系统的作用及对蜕皮激素合成的影响，为揭示ABA调控筋骨草悬浮细胞合成蜕皮激素的机制奠定基础.

1 试验与方法

1.1 试验材料

试验选取东北林业大学生命科学学院森林生物工程实验室培养的悬浮匍枝筋骨草进行继代培养.

1.2 方法

1.2.1 悬浮细胞的培养 采用赵晓杰等[8]方法.将筋骨草在固体培养基（MS+2，4-D 0.4 mg/L）上诱导成愈伤组织.将生长在固体培养基的愈伤组织，在无菌条件下接种到未添加琼脂的液体培养基内（MS+2，4-D 0.4 mg/L）进行悬浮培养，接种量为100 g/L（即每50 mL培养基中接种筋骨草细胞鲜重5 g），pH调至6.0.每隔7 d进行一次继代.本实验使用继代次数为4代的悬浮体系.培养条件：培养室内光照培养，温度为25 ℃，光/暗周期：16 h/8 h，光照强度2 000 lux，湿度为70%.摇床速度：110～120 r/min.

1.2.2 筛选ABA浓度阈值 本实验设定0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L共5个ABA质量浓度梯度，并以空白为对照.加入到接种量为100 g/L已培养7 d的悬浮体系中.观察匍枝筋骨草在不同悬浮体系中生长状态和生物量，根据培养结果，选出最适合的ABA添加浓度.

1.2.3 防御酶的提取及活性测定

（1）SOD提取与活性测定 采用南京建成生物公司提供的总SOD测试盒进行提取，称取植物组织1 g，加入9 mL 0.1 mol/L pH 7.0～7.4的磷酸缓冲液，制成100 g/L的匀浆液，3 500～4 000 r/min离心10 min，取上清液进行测定.以每1 g组织在1 mL反应液SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位.

（2）CAT提取与活性测定 采用总CAT测试盒（南京建成生物公司）提取，称取植物组织1 g，加入9 mL生理盐水，制成100 g/L的匀浆液，2 500 r/min离心10 min，取上清液进行测定.以每1 mg组织蛋白每秒钟分解1 μmol H2O2的量为一个活力单位.

（3）POD提取与活性测定 采用总POD测试盒（南京建成生物公司）提取，称取植物组织1 g，加入9 mL 0.1 mol/L pH 7.0～7.4的磷酸缓冲液，制成100 g/L的匀浆液，3 500 r/min离心10 min，取上清液进行测定.以每1 mg组织蛋白每分钟分解1 μg底物的酶量为一个活力单位.

（4）PAL提取与活性测定 参照李靖[9]等的方法测定.取1 g（鲜质量）悬浮细胞，加入少量 PVP和石英砂，4 ℃下研磨，加入5 mL预冷的酶提取液（0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 pH 6.0，含2 mmol/L EDTA，4 mmol/L DTT）匀浆，混匀后10 000 r/min 4 ℃离心15 min，上清为胞内酶待测液.1 mL酶待测液（同时以1 mL蒸馏水为对照），加入2 mL 0.01 mol/L且pH 8.8 的硼酸缓冲液，1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，混匀，37 ℃保温30 min后，加入0.2 mL盐酸终止反应.测定290 nm处的吸光值.以每分钟吸光值增加 0.01所需酶量为1个酶活性单位（U）.