长顺绿壳蛋鸡PRL基因的克隆及序列分析

韩雪++朱丽莉++粟朝芝++吴松成++陶宇航

摘要：采用特异性引物PCR技术获得长顺绿壳蛋鸡PRL基因，将其克隆至pGM-T载体，并对该序列进行测序分析。结果表明，长顺绿壳蛋鸡PRL基因全序列长度为690 bp，包含5个外显子和4个内含子，编码229个氨基酸。将长顺绿壳蛋鸡PRL基因与GenBank已公布的鸡、鸭、鹅、鱼等动物的PRL基因序列进行同源性比较，发现亲缘关系越远则同源性越低。

关键词：长顺绿壳蛋鸡；催乳素基因；克隆；序列分析

中图分类号： Q785文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0082-03

收稿日期：2015-10-13

基金項目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合J字[2011]2174）；贵州省农业科学院研究生创新基金（编号：黔农科合[创新基金]2010011）；贵州省动植物育种专项（编号：黔农育专字[2011]027）；贵州省农业科学院专项（编号：黔农科院院专项[2014]006号）。

作者简介：韩雪（1982—），女，江苏徐州人，硕士，助理研究员，主要从事动物遗传育种研究。E-mail：hanxue8855601@126.com。

通信作者：陶宇航，副研究员，主要从事家禽养殖研究。E-mail：1043694421@qq.com。

催乳素（prolactin，PRL）是动物垂体前叶嗜酸细胞分泌的一种多肽类激素，对哺乳动物的乳腺发育、泌乳、卵巢功能、维持妊娠、机体免疫等具有重要的生物学效应[1]。在家禽中，PRL是促进母禽就巢孵卵行为和调控生殖活动的关键激素[2]，就巢期间PRL表达量升高可抑制垂体促性腺激素的分泌，致使卵巢萎缩，排卵泡停止，最终终止产蛋[3]。很多物种PRL基因的cDNA或基因全序列已被测定，其转录产物在不同物种中高度保守。对人、鸡、鸭、鹅等动物的研究表明，PRL基因由5个外显子和4个内含子构成。禽类PRL前体含229个氨基酸，其中包括30个氨基酸的信号肽序列和199个氨基酸的PRL成熟蛋白[4]。

长顺绿壳蛋鸡因其产地地处贵州省长顺县而得名，是中国稀有的珍禽品种。长顺绿壳蛋鸡是在贵州省特定自然生态环境下，经长期自然选择和人工选择而形成的品种，具有耐粗饲、抗病力强、觅食能力强等特点。然而，长顺绿壳蛋鸡产蛋量低、就巢性强，严重限制了其产业化发展。以长顺绿壳蛋鸡为研究对象，克隆其催乳素基因并进行测序分析，为长顺绿壳蛋鸡品种资源的保护利用及其产蛋性能的提高提供依据。

1材料与方法

1.1材料

血样采自贵州省长顺县长寨镇新民村长顺绿壳蛋鸡纯种繁殖场，翅静脉采血，共采取30羽长顺绿壳蛋鸡的血样。所有母鸡均在相同环境下单笼饲养，采取的血样经EDTA抗凝剂抗凝，送至实验室于-20 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1DNA提取

采用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取血样中的DNA。

1.2.2引物设计

根据GenBank已公布的禽、鼠等PRL基因序列，采用Primer 5.0软件在序列保守区设计引物，引物序列见表1，由北京鼎国生物技术有限公司合成。

1.2.3PCR扩增与测序

50 μL PCR反应体系为10×PCR Buffer 5 μL、dNTP（10 μm） 1 μL、Template 1 μL、primer-F（10 μm） 1 μL、primer-R（10 μm） 1 μL、rTaqDNA聚合酶（2 U/μL） 0.5 μL，最后采用ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52～47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共50个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京鼎国生物技术有限公司进行克隆和测序。

1.3数据处理

将PRL基因5个外显子片段进行拼接，并采用GenBank数据库进行BLAST分析。同时，将cDNA序列翻译成氨基酸序列，确定正确的开放阅读框（open readingf rame，ORF）；采用DNAman软件（www.dnastar.com）对长顺绿壳蛋鸡PRL基因序列与GenBank数据库公布的其他动物PRL基因序列进行核苷酸、氨基酸序列同源性比较及生物信息学分析。

2结果与分析

2.1长顺绿壳蛋鸡PRL基因的PCR扩增

以长顺绿壳蛋鸡血总DNA为模板，利用5对特异引物分别进行PCR扩增，扩增产物与预期片段大小吻合，引物扩增结果见图1。

2.2重组质粒的酶切鉴定

将重组质粒导入大肠杆菌，经过蓝白斑和抗性筛选，提取阳性大肠杆菌并进行质粒提取，然后对质粒进行EcoRⅠ酶切鉴定。结果表明，重组质粒构建成功，将阳性克隆送至北京鼎国生物技术有限公司测序，最后对其外显子序列进行拼接。

2.3长顺绿壳蛋鸡PRL基因的序列测定

序列测定结果（图2）表明，长顺绿壳蛋鸡PRL基因 cDNA 片段长690 bp，共编码229个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

[FK（W13][TPHX1.tif]

[FK（W22][TPHX2.tif]

2.4PRL基因核苷酸和氨基酸序列同源性比较

将长顺绿壳蛋鸡PRL基因序列与GenBank数据库上获取的鸡、鸭、鹅、鱼等动物的PRL基因序列（表2）进行同源性分析。由表3可知，禽类PRL基因编码区序列具有高度的保守性。其中，长顺绿壳蛋鸡与白来航、太和丝羽乌骨鸡、隐性白洛克的核苷酸序列同源性最高，为99.9%；与尖嘴鲈的同源性最低，仅为47.3%。氨基酸序列同源性比较可得到与核苷酸序列相似的结果。

2.5系统发育分析

将PRL基因序列绘制进化树（图3）。遗传进化分析表明，长顺绿壳蛋鸡与杨山鸡、太和丝羽乌骨鸡、白来航的亲缘关系较近，与人、鲤鱼、尖嘴鲈的亲缘关系较远。

3结论与讨论

大多数研究者认为，PRL是促进母禽就巢孵卵行为和调控[CM（25]生殖活动的关键激素[5]，过高和过低的催乳素均对卵泡发

育不利[6]。Dawson等研究发现，火鸡和鸽刚就巢时，PRL显著升高以维持正常的孵化期[7]。Reddy等研究发现，催乳素水平与鸡的产蛋量呈负相关[8-9]。PRL必须通过受体作用于靶细胞，[JP2]从而产生各种生理效应。目前，关于催乳素受体基因（prolactin receptor，PRLR）与家禽就巢性之间的相关性研究表明，二者间相关不显著[10]。雌激素受体基因（estrogen receptor，ER）、VIP、垂体特异转录因子（pituitary-specific transcription factor，POU1F1）基因等也会影响家禽就巢性，因此这些基因也是就巢性候选基因[11]。虽然学者已对这些基因开展了大量研究，但均侧重于单基因研究，为揭示其就巢性机理，必须从PRL表达调控信号通道进行更系统的研究。

本研究结果表明，长顺绿壳蛋鸡PRL基因编码区序列全长为690 bp，共编码229个氨基酸，基因推导的蛋白分子量为 29.122 ku，理论等电点pI为5.94，表明编码肽链偏酸性。PRL氨基酸残基二级结构由41.58% α-螺旋、14.34% β-折叠、44.07%无规卷曲3种结构组成。将克隆获得的长

[FK（W25][TPHX3.tif]

顺绿壳蛋鸡PRL基因与GenBank数据库公布的鸡、鸭、鹅、鱼等动物的PRL基因序列进行同源性比较，发现长顺绿壳蛋鸡与禽类的同源性均高于90%，氨基酸序列同源性高于90%。与其他动物PRL基因相比较，发现亲缘关系越远则同源性越低。同源分析结果表明，禽類PRL基因编码区序列高度保守，可见物种分化以后，作为影响哺乳动物产乳性状的PRL发生了较大变异，这为PRL特性和作用机理的进一步研究以及哺乳动物产乳和繁殖性能的改良提供依据。

在禽类进化的过程中，家鸡、火鸡、鹌鹑首先发生分支，而鹅与鸭的分支则较晚，这与序列分析结果一致。由于起源与进化不同，长顺绿壳蛋鸡与原鸡、白来航、杨山鸡、太和丝羽乌骨鸡、隐性白洛克聚为一类，再与鹌鹑、火鸡、印度孔雀聚为一类，分支最外侧的为人、鲤鱼、尖嘴鲈。长顺绿壳蛋鸡、原鸡、白来航、杨山鸡等禽类与鱼类的亲缘关系相对较远，这与古生物学、形态学、生化遗传学、细胞遗传学以及其他DNA分子水平上的分类结果基本一致，这也佐证了PRL基因全序列适合用于研究动物种间系统进化关系。

[HS2*2][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]

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