林木组培快繁技术中常见问题及对策

2017-04-04陈罡

防护林科技 2017年4期

关键词：褐化玻璃化外植体

陈罡

(辽宁省林业科学研究院，辽宁沈阳 110032)

林木组培快繁技术中常见问题及对策

陈罡

(辽宁省林业科学研究院，辽宁沈阳 110032)

针对林木组培快繁过程中经常出现的污染、褐化及玻璃化问题的产生原因和控制措施进行了综述，为今后林木组培快繁研究提供技术参考，同时也为开展新品种苗木组培的科研和生产提供理论基础和实践指导。

林木；组织培养；污染；褐化；玻璃化

植物组培快繁技术是在植物细胞具有全能性的基础上发展起来的无性繁殖技术，该技术已有100多年的历史，至今已日趋成熟[1]。其技术核心是通过无菌操作，将从植物体中分离出所需的细胞、组织、器官等在人工控制条件下进行培养并获得再生的完整植株或生产具有经济价值产品的现代生物技术。目前，已在花卉、蔬菜、作物、经济植物及珍稀植物中的科研和生产中广泛应用，也是植物转基因、遗传育种、脱毒培养及种质资源保护等研究中的重要技术手段。由于组培快繁技术不受地域、气候等条件限制，一旦获得植物材料便可进行繁殖等优点，对于生长周期长，某些有性繁殖困难以及扦插成活率低的林木来说，更是具有巨大的应用价值，目前已有200多种木本植物开展了组织培养、体细胞培养及工厂化育苗等研究。在进行林木组培快繁工作时，由于操作不当、林木一些自身生理特性及外界环境条件等原因，常会遇到污染、褐化和玻璃化等一系列难题，影响植物材料的正常发育，严重时，会给科研和生产带来巨大的经济损失。因此，了解这些问题产生的原因、影响因素及解决方法，不仅可以节省技术成本，更是提高林木组织培养成功率的关键，同时为今后开展组培快繁新技术提供参考。

1 污染及对策

微生物污染问题始终出现并贯穿整个组培过程，如何避免和降低污染率是植物组培快繁技术的首要难题。微生物污染主要分为接种前污染、接种中污染和接种后污染3个阶段。接种前污染即前期准备阶段，主要由培养基、接种工具、接种环境灭菌和消毒不彻底引起的[2]；接种中污染即无菌操作阶段，主要由超净工作台滤除菌超标、外植体消毒处理不当、无菌操作不规范造成操作过程中有交叉污染等引起的[3]；接种后污染即培养阶段，主要由培养环境不洁净以及由真菌和细菌引起的内源菌污染等[4]。

对于避免接种前污染，要做到定期对接种环境进行通风换气和消毒，紫外线照射消毒，75%酒精喷雾消毒，培养基及接种器具力求彻底高压灭菌消毒，培养基即配即用，对于剩余放置超过一周的培养基和器皿再次使用要进行二次消毒，避免非工作人员进出接种室，每次接种前要对超净工作台面和接种室进行紫外灯灭菌30 min。对于预防接种中污染，主要是外植体合理的选择和适宜的处理[5]。首先要根据不同材料选择合适的外植体，再根据外植体选择与其相适宜的消毒剂和消毒方法，如一般常选用的消毒剂有乙醇、氯化汞、次氯酸钠、过氧化氢等，先根据每种消毒剂的特性，对消毒剂浓度和时间进行预试验后再确定最佳消毒体系，如有需要，也可以将消毒剂进行组合使用。

木本植物木质化程度高，尽量避免选取木质化茎，而选取胚、幼嫩茎尖、当年新生枝条等为外植体，选取原则是污染少。如有条件，最好是能够将植物或枝条在室内培养一段时间后再取。针对不同外植体选择不同消毒剂类型、浓度和消毒时间，初次接种时，要根据不同植物品种对其进行试验摸索，既能将消毒率达到最高，又对外植体的伤害降到最低。接种过程中操作人员要严格按照实验室无菌操作流程进行，工具用一次消毒一次，培养器皿瓶口用70%酒精擦拭后在开盖，以避免交叉污染。此外，要对超净工作台洁净等级和工作状态进行定期检查。为防止培养阶段污染，培养环境要洁净，可根据需要在培养基中加入药剂以抑制内源污染菌，如抗生素、单宁酸等抑菌剂。在使用抑菌剂时要注意抑微生物污染的种类和使用浓度，要注意避免对培养的植物组织有不良影响。此外，如单独使用抑菌剂效果不理想，也可在培养基中加两种或两种以上抑菌剂[6]。

2 褐化及对策

褐化现象是木本植物组织培养中的常见问题，即外植体在培养过程中培养基和培养物变褐而最终导致培养物死亡的现象[7]，它能够严重影响外植体再分化和脱分化进程。褐化与外植体内酚类物质的含量呈正相关，因此又称酚污染[8]。由于酚类糖苷化合物的含量又与植物中的木质素、单宁和色素含量相关，而在木本植物中三者的含量要比草本植物高，因此木本植物更容易发生褐化现象[9]，也是木本植物组培快繁能否取得成功的重要因素。已有研究表明，产生褐化的原因主要有两个方面：一个是非酶促褐化，一个是酶促褐化[10]。非酶促褐化主要是由外界环境引起的程序化死亡[9]；酶促褐化是培养物组织中多酚氧化酶、过氧化物酶或苯丙氨酸解氨酶等被激活[11]，将多酚化合物氧化成褐色的醌类物质，这些醌类物质引起外植体中其他酶失活，导致代谢紊乱，生长受阻[12]。影响褐化发生的主要因素有三个方面：外植体的选择(外植体年龄、大小、种类、和消毒等)、培养条件(温度、光照和pH值等)和培养基(培养基成分、状态、硬度和激素、添加剂等)[13]。

在实际培养过程中，外植体的褐化一般会受到以上多种因素的相互作用的影响，因此防止褐化发生也是多种多样，然而每种方法都有一定适用性和局限性，因此，要根据具体实际情况，有选择性的采取相应措施抑制或减轻褐化现象的发生。首先要选择适宜的外植体。在木本植物中，多年生、木质化程度高的枝条褐化程度高，高度分化的组织易发生褐化[14]，在选取外植体时应选择幼龄枝条或当年生枝条，外植体采样时间则尽量选在冬春季，处于休眠期的枝条酚类物质含量较少，在对外植体进行消毒时，消毒时间不宜过长。其次，在接种前先将外植体遮光低温一段时间，再用无菌水反复清洗可起到减轻外植体的褐化作用。祁翔等[15]对红掌组培研究中发现在接种前培养基中添加抗氧化剂有助于减少外植体的褐化。适宜的培养基和培养环境能够很好地调控褐化现象。再次，要注意培养基成分、蔗糖浓度和生长调节剂水平的配比。一般来说，固体培养基的褐化率最高，而液体培养基褐化率低[16]。无机盐和大量元素浓度偏高会使褐化率增高，微量元素偏多会使褐化率减低，细胞分裂素的浓度也不宜过高，较低的pH值可以抑制褐化的发生。在培养基中加入防褐剂(抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸钠、硝酸银、柠檬酸)和吸附剂(活性炭)是目前常用的一种有效措施，李萍等[17]研究了4种防褐剂对牡丹组培中褐化的控制作用及对组培苗的生长和增殖作用，较好地解决了牡丹组培快繁中的褐化问题。此外，还要注意调节光照、温度和通风。15 ℃～20 ℃、弱光或黑暗条件下培养可减轻培养物褐变的发生。

3 玻璃化及对策

玻璃化也是在草本和木本植物组织培养过程中经常遇到的不良现象，是指在培养过程中，组培苗生长异常，呈半透明鲜绿水渍状[1]。叶片纵向卷曲或肿胀，且脆弱易碎。玻璃化苗内体含水量高、营养物质含量少、光合能力差、酶活性低，其继代培养分化能力低，生根培养困难，移栽后不易成活[18]。

在林木组培过程中有许多因素会产生玻璃化苗，主要包括外植体材料本身、培养基条件和培养环境几个方面。外植体的种类和类型会影响玻璃化的产生，选取幼小外植体容易发生玻璃化现象[13]。从培养基状况来看，产生玻璃化苗的因素包括培养基中pH值、激素水平、蔗糖、琼脂以及NH4+的浓度等；培养条件也是产生玻璃化的关键因素。培养环境中的温湿度和光照等均在不同程度上影响着玻璃化苗的发生率。因此为防止玻璃化苗的出现，应从以上因素着手解决，尤其是在培养基条件和培养环境上。可以使用固体培养基，适当增加琼脂和蔗糖浓度降低培养基渗透势或使用渗透剂[1]，以及酸性条件培养等来降低玻璃化程度。杨雪等[19]对红叶石楠组培苗玻璃化影响因子及其克服技术进行了研究，结果表明，培养基离子浓度或细胞分裂素增高玻璃化苗增多，降低温度或提高培养基硬度可使玻璃化苗减少，卡拉胶比琼脂更容易导致玻璃化。邹恩强等[20]研究表明，在培养中适当降低外源细胞分裂素(BA)和NH4+的浓度，可有效降低玻璃化的发生。

胡淑英等[21]在对滨梅组培苗玻璃化成因及克服技术研究中发现，培养温度和光照时间是玻璃化的重要影响因子，因此要注意对培养温度的控制，避免环境温度过高，必要时还要进行低温处理来消除玻璃化。还应注意对光照时间和光照强度的控制，培养初期可适当进行弱光培养或暗培养，分化阶段再进行强光培养，适当增加自然光照，自然光中的紫外线可以促进组培苗成熟，抑制玻璃化的产生[13]。此外还要注意培养容器的通风，通气性差的封口膜可提高玻璃化苗的发生率，因此，要选择通透性好的透气膜以促进气体交换，降低培养容器内的相对湿度以减少玻璃化的出现。

4 展望

开展林木组培快繁技术研究，对促进林木良种选育、保护珍优林木品种、推广种植优良树种以及满足苗木市场需求等方面具有十分重要意义。但在进行林木组培快繁研究和生产中，不可避免地会受到污染、褐化以及玻璃化现象的影响，这不仅费时费工提高研究和生产成本，更会影响林木种苗的技术推广及工厂化生产的实施与进度。因此，如何更好地避免和解决三大问题，是林木组培研究急需解决的问题，使其在科研和生产上得以广泛应用。本文阐述了这些问题的产生原因以及解决方法，既可以预防和控制其发生，对于已发生问题的组培苗，又可通过以上解决措施进行二次处理后重新培养，以免造成更大损失。随着科学水平的持续发展，基础理论的不断深入、组培新技术[22](开放式组培、光自养组培)的不断更新以及技术设备的日益完备，组织培养中三大难题的控制措施，尤其是褐化与玻璃化机制研究将会取得更大的进展。

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