高温高湿下辣椒抗病分子机制及其遗传改良技术与应用

官德义，王再兴，罗 英，徐小万，宋占锋，何水林*

(1.福建农林大学作物科学学院 350002； 2.福建省惠安县农业科学研究所；3.福建省三明市农业科学研究院； 4.广东省农业科学院蔬菜研究所；5.四川省农业科学院园艺所)

高温高湿下辣椒抗病分子机制及其遗传改良技术与应用

官德义1，王再兴2，罗 英3，徐小万4，宋占锋5，何水林1*

(1.福建农林大学作物科学学院 350002； 2.福建省惠安县农业科学研究所；3.福建省三明市农业科学研究院； 4.广东省农业科学院蔬菜研究所；5.四川省农业科学院园艺所)

高温高湿环境下病害严重发生是导致我国南方辣椒露地栽培和设施栽培减产的重要障碍因素。该文对辣椒应答高温高湿胁迫和病原菌侵染的分子机制进行研究，发现了以CaWRKY40为中心的转录调控网络在辣椒耐高温、抗病及高温高湿下抗病表现中起重要的调节作用。在此基础上建立了病圃与高温高湿处理相结合的生态压力选择法与CaWRKY40转录表达量相结合的资源筛选体系，对通过有性杂交、诱变等创制的中间材料实施在高温高湿环境下的抗病资源筛选与新品种选育，选育出的辣椒新品种均表现出在高温高湿环境下较高的抗病水平，适合在我国南方地区进行露地栽培或设施栽培。

辣椒；高温高湿；抗病性；生态压力选择；育种

Abstract: Severe disease damage under hot and humid environment is the important factor which reduces the yield of pepper cultivated in open field and greenhouse in south of our country. In this study, the molecular mechanism for pepper response to high temperature and humidity and pathogen infection was studied, and the functions of CaWRKY40 transcription and regulation in pepper heat-tolerance, disease-resistance, and disease-resistance under high temperature and humidity condition had been summayized. On the above basis, the pepper varieties selection were established by ecological pressure selection, based on diseased nursery and high temperature and humidity treatment, combined with levels of CaWRKY40 transcription and expression. A series of new Minjiao pepper varieties were bred by selection on various pepper germplasm resources obtained by sexual hybridization and mutation, and all of them were highly resistant to diseases under hot and humid environment, which could be applied in south China in open and protected cultivation.

Keywords: Pepper; high temperature and humidity; disease resistance; ecological pressure selection; breeding

辣椒在我国播种面积仅次于大白菜，也是产值较大的蔬菜作物之一。近年来，我国辣椒生产的经济效益逐年提高，带动了辣椒生产面积特别是设施生产面积的迅速扩大。在我国各辣椒产区，特别在华南和西南等辣椒产区，露地栽培辣椒的生长季节在4-6月，正值高温高湿时期，土传病害的发病率在20%～80%，常常导致辣椒的减产甚至绝收，严重影响辣椒产量和效益。在近年来迅速发展的冬春季设施栽培辣椒生产中，受高温高湿环境的影响，辣椒白粉病、疫病、菌核病等发病日益严重。虽然施用农药可在一定程度上缓解病害危害，但不可避免地带来成本升高、环境污染和农药残留等问题。培育和推广应用抗病品种是解决辣椒病害问题最为经济有效的技术对策。然而，长期以来，在辣椒育种中对高温高湿环境下抗病问题没有给予足够重视，缺乏有效的技术，辣椒高温高湿病害严重发生的问题未能有效解决。因此，开展高温高湿下辣椒抗病遗传改良技术策略的创新和应用是当前和今后的重要课题。

1 高温高湿环境下辣椒抗病分子机制研究

1.1辣椒耐高温高湿和抗病偶联假说

辣椒是典型的茄科植物，适合在温暖季节的旱地种植，但由于疫霉和青枯菌等土壤传播病害多，在春夏季高温高湿环境下，一方面促进了病原菌的发生和发展；另一方面则可能造成植株的生长势弱，导致辣椒病害发生严重。高温高湿和病害构成了辣椒进化过程中的外部环境选择压力。据此，提出辣椒耐高温高湿和抗病偶联假说，即辣椒在高温高湿发病严重的自然选择压力下进化，形成其应答高温高湿和病原菌侵染防御反应之间的彼此关联和高温高湿环境下抗病机制[1-4]。

1.2CaWRKY40介导的辣椒协同应答高温高湿和抗病的分子机制

通过开展辣椒协同应答高温高湿和病原菌侵染的信号通路的分子剖析，发现了CaWRKY40、CaWRKY6、CaWRKY27、CaCDPK15、CabZIP63、CaROP1等基因在青枯菌或疫霉等病原菌的侵染下或高温高湿处理下表达均上调，这些基因在烟草中过量表达可显著提高转基因烟草植株对高温高湿的耐性和对青枯菌接种的抗性；相反，当这些基因发生病毒诱导的基因沉默时，辣椒植株耐高温高湿和抗青枯菌接种的水平显著降低。与上述结果相对应的是，过敏反应相关标记基因(HIN1，HSR515等)、SA通路相关的PR基因、JA通路相关的PR基因等的表达均发生相应的变化，即在CaWRKY40、CaWRKY6、CaWRKY27、CaCDPK15、CabZIP63、CaROP1等过量表达条件下表达上调，但在上述基因沉默的辣椒植株中表达下调。此外，研究还发现CaWRKY40基因受高温高湿或青枯菌接种的转录受到CaWRKY6和CabZIP63的直接调控，受到CaROP1和CaCDPK15间接调控，而且CaWRKY40可结合到CaWRKY27、CaCDPK15、CabZIP63等基因启动子及CaWRKY40本身的启动子，转录调节这些基因的表达，构成一系列正反馈调节环。

CaWRKY40可调节辣椒中71个WRKY转录因子中的59个的转录表达，且对28个R蛋白、LRR激酶受体蛋白的编码基因，以及SA、JA、ET、ABA、IAA和CKT等信号通路中多个调节蛋白的编码基因的转录起重要调节作用[1-4]，CaWRKY40的靶基因中还含有HAD、HAC等与植物染色体结构修饰及表观遗传学调节有关的蛋白的编码基因，且受到CaWRKY40的转录调控(本课题组未发表资料)。这些结果均表明CaWRKY40在辣椒耐高温高湿和抗病中起重要调节作用，强化CaWRKY40介导的信号通路可能是开展辣椒高温高湿环境下抗病遗传改良的重要途径。

因此，在辣椒中存在协同应答高温高湿和抗病的机制，在高温高湿环境下CaWRKY40的表达量升高，不仅有利于提高辣椒的耐高温高湿水平，还可提高辣椒的抗病水平。

2 辣椒遗传改良技术策略与应用

2.1建立和应用辣椒多病圃高温高湿生态压力选择技术，结合辣椒根部CaWRKY40转录表达验证，筛选辣椒在高温高湿环境下表现抗病的种质资源

鉴于辣椒中存在着协同应答高温高湿和病原菌侵染或在高温高湿环境下表现抗病的分子机制。因此，通过人工设置高温高湿和病原菌侵染的环境，可以筛选出在高温高湿环境下表现抗病的种质资源。项目组针对辣椒土传病害多的特点，在福建泉州、三明，广东广州和四川成都等地建立辣椒连作病圃(连作5年以上)，在春季大棚和露地栽培中营造高温高湿环境，促进辣椒发病，借此开展辣椒在高温高湿环境下抗病资源的筛选。鉴于各地自然条件的差异，辣椒病原生理小种不同，多病圃生态压力选择有利于提高筛选结果的稳定性。

2.2挖掘高温高湿环境下抗病辣椒种质资源，构建新品种选育的核心亲本种质资源

从1998年开始，项目组从国内(包括台湾地区)及国外(美国、韩国、墨西哥、巴西、印度尼西亚、印度、巴基斯坦、泰国)广泛收集到500多份辣椒种质资源。此外，还利用辣椒作为常异花授粉作物的天然异交特性，系统选择优良自交系；或采取自交系辐射诱变等多种手段，创造广泛变异。

对现有的1000多份辣椒种质资源材料实施多病圃高温高湿环境下发病生态压力选择，最终发现有147份种质资源在高温高湿环境下表现抗病，其中：对青枯病表现中抗的资源有38份，抗的资源有14份，高抗的资源有9份；对疫病表现中抗的有48份，抗的有23份，高抗的有15份。以上资源构成了高温高湿环境下抗病辣椒育种的核心种质资源。

2.3创制高温高湿环境下抗病的辣椒及主要农艺性状优异的新种质，构建新品种选育的直接或间接亲本

从上述核心种质中初选出79-5、79-7C-3-CS1、68-2、76B-5、69-9-2、42-3-A-1-2-1-1、HN42-2-1-CS2、101-1-C-2-3-CS1、YN10-1-1-9、GZ03-1-1-CS1、DFF-62-2-CS1、GZC13-109-2-1、GZC13-88-2-1-2等 65份在高温高湿环境下表现抗病的辣椒种质资源，继续开展高温高湿环境下病圃筛选，分别筛选出高温高湿环境下抗病兼具丰产性状的单株26个，分单株留种，并依次对选留的单株进行连续5、6代的自交纯合和系统选择，育成36份在高温高湿环境下表现抗病性强、早熟、丰产、优质的辣椒新品系，用作高温高湿环境下抗病辣椒新品种选育的直接亲本。

3 高温高湿环境下抗病新品种的选育及其推广应用

以上述高温高湿环境下抗病的辣椒及主要农艺性状优异的新种质作为亲本，选育出闽椒1号、闽椒2号、闽椒3号、闽椒4号、明椒3号、明椒4号、明椒5号、明椒6号、川腾6号、川腾9号等辣椒新品种。选育出的新品种不仅产量高、品质优，且均表现出一定的耐高温高湿特性，以及在高温高湿环境下表现抗病，适合在我国南方春夏季露地种植，或作为设施栽培品种，已经在福建、江西、广东和四川等省份大面推广应用，取得了良好的经济效益、生态效益和社会效益。

[1]DANG F F，WANG Y N，YU L，et al.CaWRKY40, a WRKY protein of pepper, plays an important role in the regulation of tolerance to heat stress and resistance to Ralstonia solanacearum infection[J].Plant Cell Environ，2013，36(4)：757-774.

[2]SHEN, L，LIU Z，YANG S，et al.Pepper CabZIP63 acts as a positive regulator during Ralstonia solanacearum or high temperature-high humidity challenge in a positive feedback loop with CaWRKY40[J].J Exp Bot，2016，67(8)：2439-2451.

[3]SHEN L，YANG S，YANG L，et al.CaCDPK15 positively regulates pepper responses to Ralstonia solanacearum inoculation and forms a positive-feedback loop with CaWRKY40 to amplify defense signaling[J]. Sci Rep，2016(6)：22439.

[4]CAI H，YANG S，YANG Y，et al.CaWRKY6 transcriptionally activates CaWRKY40, regulates Ralstonia solanacearum resistance, and confers high-temperature and high-humidity tolerance in pepper[J].J Exp Bot，2015，66(11)：3163-3174.

(责任编辑：林玲娜)

Molecularmechanismofdiseaseresistanceforpepperanditsgeneticimprovementmeasuresandapplicationunderhotandhumidenvironment

GUAN De-yi1, WANG Zai-xing2, LUO Ying3, XU Xiao-wan4, SONG Zhan-feng5, HE Shui-lin1*

(1.CollegeofCropScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,FujianProvince350002; 2.Hui’anInstituteofAgriculturalSciences,FujianProvince; 3.SanmingInstituteofAgriculturalSciences,FujianProvince; 4.VegetableResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongProvince; 5.HorticulturalInstitute,SichuanAcademyofAgriculturalScience,SichuanProvince)

2017-05-29

官德义，男，1964年生，实验师。

*通讯作者：何水林，男，1965年生，教授 (E-mail：shlhe201304@aliyun.com)。

国家基金面上项目(31372061、31572136)；福建省第二轮种业工程项目(2014s1477-23)；福建省重大科技专项(2013NZ0002-3)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.06.025