下调HMGA1对乳腺癌MCF7细胞增殖和侵袭能力的影响及机制

张洋，董理，孙源博，李文媛，王莹，孙平，于伟光

(1牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011；2牡丹江医学院红旗医院)

下调HMGA1对乳腺癌MCF7细胞增殖和侵袭能力的影响及机制

张洋1，董理2，孙源博2，李文媛1，王莹1，孙平1，于伟光2

(1牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011；2牡丹江医学院红旗医院)

目的观察下调高迁移率族蛋白A1(HMGA1)对乳腺癌MCF7细胞增殖和侵袭能力的影响，并探讨其机制。方法选择人乳腺癌MCF7细胞，将其分为siRNA对照组、siRNA-HMGA1组、miR对照组和miR-24-3p组，分别转染siRNA对照慢病毒、siRNA-HMGA1慢病毒、miR对照慢病毒和miR-24-3p慢病毒。采用Western boltting法检测未转染MCF7、正常乳腺上皮细胞株(HMEC hTERT)及siRNA对照组、siRNA-HMGA1组细胞HMGA1蛋白，实时荧光定量PCR法检测miR对照组和miR-24-3p组细胞HMGA1、miR-142-3p mRNA，MTT法和Transwell法检测4组细胞增殖活力和侵袭能力，荧光素酶报告基因分析验证HMGA1与miR-142-3p靶向关系。结果MCF7、HMEC hTERT细胞中HMGA1蛋白相对表达量分别为0.574±0.075、0.234±0.099，两者相比P<0.01。siRNA-HMGA1组、siRNA对照组HMGA1蛋白相对表达量分别为0.141±0.051、0.651±0.136，两组相比P<0.01。miR-142-3p组、miR对照组HMGA1 mRNA相对表达量分别为0.135±0.046、0.604±0.156，miR-142-3 mRNA相对表达量分别为1.128±0.174、0.263±0.116，两者相比P均<0.01。MCF7细胞中HMGA1 mRNA、miR-142-3p mRNA表达呈负相关(r=-0.259，P=0.021)。siRNA-HMGA1组、siRNA对照组细胞增殖活力分别为0.535±0.066、1.160±0.125，穿膜细胞数分别为(32.05±9.33)、(71.68±14.39)个，两者相比P均<0.01。miR-142-3p组、miR对照组细胞增殖活力分别为0.362±0.121、1.083±0.139，穿膜细胞数分别为(21.52±6.64)、(46.74±7.82)个，两组相比P均<0.01。miR-142-3p组、miR对照组野生型HMGA1 3′-UTR荧光素酶活性分别为0.668±0.074、1.000±0.000，两组相比P<0.01。结论下调HMGA1乳腺癌MCF7细胞增殖和侵袭能力增强，其机制可能与HMGA1可靶向反向调控miR-142-3p有关。

高迁移率族蛋白A1；微小RNA 142-3p；乳腺肿瘤；细胞增殖；细胞侵袭

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，是全球女性因癌症导致死亡的首要原因。乳腺癌高病死率主要原因为肿瘤转移，而肿瘤转移相关基因已被证实参与肿瘤细胞增殖，因此，筛选鉴定肿瘤细胞增殖和转移的生物标志物，对乳腺癌临床治疗具有重要意义[1]。高迁移率族蛋白A1(HMGA1)是一种染色质相关蛋白质。最近研究表明HMGA1为多种恶性肿瘤的致癌基因[2]，其在乳腺癌[3]、胃癌[4]、卵巢癌[5]、非小细胞肺癌[6]、甲状腺癌[7]中表达上调，并促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移，其高表达与胃癌[4]和非小细胞肺癌[6]患者的预后呈负相关。本研究前期通过TargetScan软件发现与3′非编码区(3′-UTR)HMGA1序列相匹配microRNAs为miR-142-3p，而miR-142-3p已被证实可作为多种肿瘤的抑癌基因。研究表明,胰腺癌[8]、乳腺癌[9]和结肠癌[10]中miR-142-3p表达下调，并抑制肿瘤增殖、迁移和侵袭。但在乳腺癌细胞中HMGA1的生物学作用及对miR-142-3p的靶向调控目前尚不明确。2011年10月～2016年2月,本研究观察了下调HMGA1对乳腺癌MCF7细胞增殖和侵袭能力的影响，并探讨其对miR-142-3p的靶向调控作用，为临床乳腺癌治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器 siRNA-HMGA1慢病毒(piLenti-siRNA-HMGA1)、siRNA对照慢病毒(piLenti-siRNA-GFP)、miR-142-3p慢病毒(Lenti hsa-miR-142-3p)、miR对照慢病毒(pLenti-Ⅲ-miR-Blank)均购于美国ABM公司；HMGA1、miR-142-3p、内参U6、GAPDH引物由美国Ambion公司合成；双荧光素酶报告试剂盒购自美国Promega公司；四氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、HMGA1一抗购自美国Sigma公司；microRNA PCR Kit试剂盒购自美国Exiqon公司；TRIzol提取液购自美国Invitrogen公司。CO2培养箱(日本三洋公司)；超净台(苏州苏净安泰公司)；凝胶成像系统(北京六一公司)。

1.2 细胞来源及培养方法 人乳腺癌细胞株(MCF7)和正常乳腺上皮细胞株(HMEC hTERT)购于美国Sigma公司，并采用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，3～4 d消化传代，取生长状态良好的细胞用于实验。

1.3 HMGA1、miR-142-3p转染方法 取对数生长期MCF7细胞，将其分为siRNA对照组、siRNA-HMGA1组、miR对照组和miR-24-3p组，铺于6孔板中，1 d后进行转染。各组每孔取37 ℃预热无血清DMEM/F12培养基稀释后分别加入2 μL siRNA对照慢病毒、siRNA-HMGA1慢病毒、miR对照慢病毒和miR-24-3p慢病毒。将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养72 h后用于进一步实验。

1.4 细胞HMGA1蛋白检测 采用Western boltting法。取MCF7、HMEC hTERT及siRNA对照组和siRNA-HMGA1组细胞，应用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳提取蛋白质提取物，转移到PVDF膜，封闭后加入一抗HMGA1抗体(1∶1 000)或GADPH(1∶5 000)，加入二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBS洗净，应用显色液显示后行吸光度分析。以GADPH做校正得到积分光密度相对比值来计算细胞HMGA1蛋白相对表达量。

1.5 细胞HMGA1、miR-142-3p mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。取miR对照组和miR-24-3p组细胞，应用TRIzol提取总RNA，通过逆转录合成cDNA，根据说明书通过SYBR Green系统进行实时荧光定量。HMGA1引物序列：5′-AGGAAAAGGACGGCACTGAGAA-3′；5′-CCCCGAGGTCTCTTAGGTGTTGG-3′。GAPDH引物序列：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′；5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。miR-142-3p应用Mirvana qRT-PCR miRNA检测试剂盒进行检测。miR-142-3p引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3′；5′-CGACGTGTAGTGTTTCCTA-3′；U6引物序列：5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′；5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′。反应条件：预变性95 ℃ 60 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s共40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃15 s。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt计算HMGA1、miR-142-3p mRNA相对表达量。

1.6 细胞增殖能力观察 将上述4组细胞接种于96孔板，每孔2×103个细胞，培养6 d。在细胞生长检测时间点，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT培养2 h，丢弃培养液，PBS冲洗，每孔加入100 mL的DMSO，在570 nm波长测定吸光度值，检测细胞增殖活力[11]。

1.7 细胞侵袭能力观察 应用Transwell法观察细胞侵袭能力，分别取上述4组(8～10)×104个细胞加入到基质胶的上室，600 μL RPMI1640培养液注入下室。收集细胞后PBS冲洗和固定，0.1%结晶紫染色，拍照及显微镜下计数细胞个数。

1.8 荧光素酶报告基因分析验证HMGA1与miR-142-3p靶向关系 采用荧光素酶报告基因分析。从人基因组DNA中克隆HMGA1 3′-UTR，插入XhoⅠ与NotⅠ酶切位点之间，进行psiCHECK-2荧光素酶基因报告，通过测序验证野生型和突变型的插入序列[12]，构建含有野生型或突变HMGA1 3′-UTR序列靶位点荧光素酶报告基因载体。分别取miR对照组和miR-24-3p组细胞，接种在24孔板中。根据说明书用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 MCF7、HMEC hTERT细胞中HMGA1蛋白表达比较 MCF7、HMEC hTERT细胞中HMGA1蛋白相对表达量分别为0.574±0.075、0.234±0.099，两者相比P<0.01。

2.2 siRNA-HMGA1组、siRNA对照组HMGA1蛋白表达比较 siRNA-HMGA1组、siRNA对照组HMGA1蛋白相对表达量分别为0.141±0.051、0.651±0.136，两组相比P<0.01。

2.3 miR-142-3p组、miR对照组HMGA1 mRNA表达比较 miR-142-3p组、miR对照组HMGA1 mRNA相对表达量分别为0.135±0.046、0.604±0.156，miR-142-3 mRNA相对表达量分别为1.128±0.174、0.263±0.116，两者相比P均<0.01。

2.4 MCF7细胞中HMGA1 mRNA与miR-142-3p mRNA的关系 MCF7细胞中HMGA1 mRNA、miR-142-3p mRNA两者相对表达量呈负相关(r=-0.259，P=0.021)。

2.5 siRNA-HMGA1组、siRNA对照组细胞增殖、侵袭能力比较 siRNA-HMGA1组、siRNA对照组细胞增殖活力分别为0.535±0.066、1.160±0.125，穿膜细胞数分别为(32.05±9.33)、(71.68±14.39)个，两者相比P均<0.01。

2.6 miR-142-3p组、miR对照组细胞增殖、侵袭能力比较 miR-142-3p组、miR对照组细胞增殖活力分别为0.362±0.121、1.083±0.139，穿膜细胞数分别为(21.52±6.64)、(46.74±7.82)个，两组相比P均<0.01。

2.7 HMGA1与miR-142-3p靶向关系验证结果 miR-142-3p组、miR对照组野生型HMGA1 3′-UTR荧光素酶活性分别为0.668±0.074、1.000±0.000，两组相比P<0.01。miR-142-3p组、miR对照组突变型HMGA1 3′-UTR荧光素酶活性分别为1.020±0.031、1.000±0.000，两组相比P﹥0.05。

3 讨论

高迁移率族蛋白家族(HMG)是一系列染色质结构调控蛋白家族，在肿瘤发生发展中发挥关键作用，参与多种生物学进程，包括细胞周期调控、细胞增殖和迁移等[3]。HMGA1为HMGA家族的主要成员，HMGA1蛋白包括HMGA1a和HMGA1b，主要通过绑定位于多种基因启动子和增强子区域A/T-rich DNA序列，通过蛋白质-蛋白质作用调节染色质结构，其失调可能会导致染色体不稳定[5]。HMGA1激活IRb启动子，促进参与胰岛素抵抗(IR)表达缺失。HMGA1能够调节细胞周期蛋白E2的活动，转移Yes相关蛋白(YAP)至细胞核，进而增强细胞运动和侵袭性[13]。HMGA1高表达已被证明是肿瘤细胞的标志物，在一些肿瘤疾病的诊断和预后评估中具有重要的价值。HMGA1在肿瘤细胞通过Wnt/β-catenin和Pin1/mutant p53信号通路维持肿瘤干细胞和肿瘤转移特性[14,15]。HMGA1蛋白质已被证明是不同来源的细胞致瘤相关的“枢纽蛋白”，在促进细胞增殖和迁移中发挥重要作用[16]。HMGA1基因在人类乳腺癌中过度表达，敲除乳腺癌组织中HMGA1能显著减少锚定依赖性生长及移植瘤形成，但HMGA1在乳腺癌的生物学作用机制尚不明确。

本研究发现HMGA1在乳腺癌MCF7细胞中表达较正常乳腺细胞增高，表明HMGA1可能参与乳腺癌的发生发展过程。本研究结果表明siRNA-HMGA1组较siRNA对照组HMGA1蛋白表达低，证实siRNA-HMGA1慢病毒有效沉默HMGA1表达。进一步研究发现，siRNA-HMGA1组较siRNA对照组细胞增殖活力低且穿膜细胞数少。这表明下调HMGA1表达可抑制MCF7细胞增殖活力和侵袭能力，反向证实HMGA1能够通过促进乳腺癌细胞增殖和侵袭，在乳腺癌发病过程中发挥重要作用。

microRNAs是非编码单链RNA分子(22个核苷酸的长度)，在转录后通过与靶基因mRNA的3′-UTR发生碱基配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译[8]，在肿瘤发展过程中发挥重要调控作用。为探讨HMGA1潜在的靶点microRNA，本研究构建了含有野生型或突变3′-UTR HMGA1序列靶位点荧光素酶报告基因载体，结果发现miR-142-3p组较miR对照组野生型HMGA1 3′-UTR荧光素酶活性低，表明miR-142-3p高表达显著降低野生型HMGA1 3′-UTR荧光素酶活性。HMGA1在MCF7细胞表达显著上调，且MCF7细胞中HMGA1 mRNA与miR-142-3p mRNA表达呈负相关，进一步证实miR-142-3p是HMGA1的直接靶基因，HMGA1反向调控miR-142-3p发挥作用。miR-142-3p可作为一个独立的肿瘤抑制因子，在胰腺癌、乳腺癌和结肠癌[8～10]等多种肿瘤组织中表达下调，并抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示miR-142-3p组较miR对照组细胞增殖活力低且穿膜细胞数少，证实miR-142-3p可抑制MCF7细胞增殖活力和侵袭能力，这与以往miR-142-3p在其他肿瘤中的作用相一致[17]。因此我们推测HMGA1靶向反向调节miR-142-3p促进肿瘤细胞增殖和侵袭，这可能是HMGA1在乳腺癌中作用机制之一。

综上所述，下调HMGA1乳腺癌MCF7细胞增殖和侵袭能力增强，其机制可能与HMGA1可靶向反向调控miR-142-3p有关。

[1] Zhou L, Zhao LC, Jiang N, et al. MicroRNA miR-590-5p inhibits breast cancer cell stemness and metastasis by targeting SOX2[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017,21(1):87-94.

[2] De Martino M, Forzati F, Arra C, et al. HMGA1-pseudogenes and cancer[J]. Oncotarget, 2016,7(19): 28724-28735.

[3] Huang R, Huang D, Dai W, et al. Overexpression of HMGA1 correlates with the malignant status and prognosis of breast cancer[J]. Mol Cell Biochem, 2015,404(1-2):251-257.

[4] Jun KH, Jung JH, Choi HJ, et al. HMGA1/HMGA2 protein expression and prognostic implications in gastric cancer[J]. Int J Surg, 2015,24(Pt A):39-44.

[5] Kim DK, Seo EJ, Choi EJ, et al. Crucial role of HMGA1 in the self-renewal and drug resistance of ovarian cancer stem cells[J]. Exp Mol Med, 2016,48(e255):1-11.

[6] Lin SY, Peng F. Association of SIRT1 and HMGA1 expression in non-small cell lung cancer[J]. Oncol Lett, 2016,11(1):782-788.

[7] Zhong J, Liu C, Chen YJ, et al. The association between S100A13 and HMGA1 in the modulation of thyroid cancer proliferation and invasion[J]. J Transl Med, 2016,14(80):1-13.

[8] Mackenzie TN, Mujumdar N, Banerjee S, et al. Triptolide induces the expression of miR-142-3p: a negative regulator of heat shock protein 70 and pancreatic cancer cell proliferation[J]. Mol Cancer Ther, 2013,12(7):1266-1275.

[9] Schwickert A, Weghake E, Bruggemann K, et al. microRNA miR-142-3p inhibits breast cancer cell invasiveness by synchronous targeting of WASL, integrin alpha V, and additional cytoskeletal elements[J]. PLoS One, 2015,10(12):e0143993.

[10] Shen WW, Zeng Z, Zhu WX, et al. MiR-142-3p functions as a tumor suppressor by targeting CD133, ABCG2, and Lgr5 in colon cancer cells[J]. J Mol Med (Berl), 2013,91(8):989-1000.

[11]马素珍,潘晓丽,张方方,等.TRIM28在结直肠癌组织中的表达及其对癌细胞增殖、迁移能力的影响[J].山东医药,2017,57(10):28-30.

[12] Zhang X, Tao T, Liu C, et al. Downregulation of miR-195 promotes prostate cancer progression by targeting HMGA1[J]. Oncol Rep, 2016,36(1):376-382.

[13] Pegoraro S, Ros G, Ciani Y, et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness[J]. Oncotarget, 2015,6(22):19087-19101.

[14] Liu K, Zhang C, Li T, et al. Let-7a inhibits growth and migration of breast cancer cells by targeting HMGA1[J]. Int J Oncol, 2015,46(6):2526-2534.

[15] Zhou WB, Zhong CN, Luo XP, et al. miR-625 suppresses cell proliferation and migration by targeting HMGA1 in breast cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,470(4):838-844.

[16] Sumter TF, Xian L, Huso T, et al. The high mobility group A1 (HMGA1) transcriptome in cancer and development[J]. Curr Mol Med, 2016,16(4):353-393.

[17] Cao XC, Yu Y, Hou LK, et al. miR-142-3p inhibits cancer cell proliferation by targeting CDC25C[J]. Cell Prolif, 2016,49(1):58-68.

Effectsofdown-regulationofHMGA1onproliferationandinvasionofbreastcancerMCF7cells

ZHANGYang1,DONGLi,SUNYuanbo,LIWenyuan,WANGYing,SUNPing,YUWeiguang

(1MudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157011,China)

ObjectiveTo investigate the effects of the down-regulation of high mobility group protein A1 (HMGA1) on the proliferation and invasion of breast cancer MCF7 cells and its mechanism.MethodsThe human breast cancer cell line (MCF7) was divided into four groups: siRNA control group, siRNA-HMGA1 group, miR control group, and miR-24-3p group; MCF7 cells in the above groups were transfected with siRNA control lentivirus, siRNA-HMGA1 lentivirus, miR control lentivirus and miR-24-3p lentivirus, respectively. The protein expression of HMGA1 was detected in MCF7 cells, normal breast epithelial cell line (HMEC hTERT), siRNA control group, and siRNA-HMGA1 group by using Western blotting; the HMGA1 and miR-142-3p mRNA expression and its correlation was detected in the miR control group and miR-24-3p group by real-time quantitative PCR; the cell proliferation and invasion were detected in the four groups by MTT and Transwell assay; Luciferase reporter experiment was used to verify the target relationship between HMGA1 and miR-142-3p.ResultsHMGA1 protein expression in MCF7 cells was 0.574±0.075, which was significantly higher than that of HMEC hTERT cells (0.234±0.099) (P<0.05), and the expression of HMGA1 in siRNA-HMGA1 group (0.141±0.051) was lower than that of siRNA group (0.651±0.136) (P<0.05); HMGA1 mRNA expression in the miR-142-3p group was lower than that of the miR control group (0.135±0.046 vs 0.604±0.156), and the miR-142-3 mRNA expression was higher than that of the miR control group (1.128±0.174 vs 0.263±0.116) (allP<0.01); the expression of HMGA1 mRNA and miR-142-3p mRNA was negatively correlated (r=0.259,P<0.05); the cell proliferation in the siRNA-HMGA1 group was lower than that of the control group (0.535±0.066 vs 1.160± 0.125), transmembrane cell number was also lower than that of the siRNA group (32.05±9.33 vs 71.68±14.39) (P<0.05); the cell proliferation ability of miR-142-3p group was lower than that of the miR group (0.362±0.121 vs 1.083±0.139), and the transmembrane cell number was also lower than that of the miR group (21.52±6.64 vs 46.74±7.82) (P<0.05); in the miR-142-3p group and the miR control group, the Dual luciferase reporter assay demonstrated that the HMGA1 3′-UTR luciferase activity in wild-type was 0.668±0.074 and 1.000±0.000, respectively (P<0.01).ConclusionThe down-regulation of HMGA1 expression can promote the proliferation and invasion of breast cancer cells by reversely regulating miR-142-3p expression.

high mobility group protein A1; microRNA-142-3p; breast carcinoma; cell proliferation; cell invasion

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.005

R735

A

1002-266X(2017)38-0015-04

国家自然科学基金资助项目(81371362)；黑龙江省自然科学基金项目(H201377)。

张洋(1987-)，女，博士，讲师，主要研究方向为肿瘤转移机制。E-mail: 978619420@qq.com

于伟光(1987-)，男，博士，主治医师，主要研究方向为肿瘤转移机制。E-mail: Yingwang770224@163.com

2017-03-29)