Xpert Mtb/RIF技术在结核性脑膜炎诊断中的应用

范秀博，闫菊娥，李毓新，吉智，李妍

(1西安交通大学医学部公共卫生学院，西安710061；2西安医学院第二附属医院；3陕西省结核病防治研究所)

Xpert Mtb/RIF技术在结核性脑膜炎诊断中的应用

范秀博1,2，闫菊娥1，李毓新2，吉智2，李妍3

(1西安交通大学医学部公共卫生学院，西安710061；2西安医学院第二附属医院；3陕西省结核病防治研究所)

目的探讨利福平(RIF)耐药实时荧光定量核酸扩增技术，即Xpert 结核分枝杆菌(Mtb)/RIF 技术在结核性脑膜炎诊断中的应用价值。方法分别采用抗酸染色法、培养法、Xpert Mtb/RIF技术对34例核性脑膜炎、43例疑似结核性脑膜炎、20例非结核性脑膜炎患者的脑脊液进行Mtb检测。结果34例结核性脑膜炎患者的脑脊液用抗酸染色法、培养法、Xpert Mtb/RIF技术检测到Mtb者分别为1、2、8例，阳性率分别为2.94%、5.88%、23.53%；抗酸染色法与培养法检测阳性率相比，Pgt;0.05；培养法与Xpert Mtb/RIF技术检测阳性率相比，Plt;0.05；Xpert Mtb/RIF技术与抗酸染色法检测阳性率相比，Plt;0.05。43例疑似结核性膜炎患者的脑脊液用抗酸染色法、培养法、Xpert Mtb/RIF技术检测到Mtb者分别为0、1、6例，阳性率分别为0、2.33%、13.95%；抗酸染色法与培养法检测阳性率相比，P=0.5；培养法与Xpert Mtb/RIF技术检测阳性率相比，Pgt;0.05；Xpert Mtb/RIF技术与抗酸染色法检测阳性率相比，Plt;0.05。20例非结核性脑膜炎患者的脑脊液用抗酸染色法、培养法、Xpert Mtb/RIF技术均未检测到Mtb。结论Xpert Mtb/RIF技术检测脑脊液中的Mtb更有助于结核性脑膜炎的诊断。

核酸扩增技术；Xpert结核分枝杆菌/利福平技术；结核分枝杆菌；结核性脑膜炎；脑脊液

结核病是一个重要的全球性问题。在我国，结核病患者的死亡率仅低于艾滋病患者的死亡率，结核病已成为第二大传染病[1]。2010年全国第5次结核病流行病学抽样调查结果显示，全国活动性肺结核患者高达499万例，每年新发肺结核患者约100万例[2]。结核病的临床表现形式多样，不但包括肺结核还包括肺外结核，而肺外结核中又以结核性脑膜炎最为常见，占结核病的0.5%～1.0%[3]。结核性脑膜炎是由结核分枝杆菌(Mtb)通过淋巴系统或血液系统播散入脑而引起的脑膜、脊膜的慢性非化脓性炎症。由于结核性脑膜炎的致死率、致残率非常高，迫切需要一种能快速、准确检测Mtb的方法，以便于结核性脑膜炎的及时确诊。目前，国内外有文献[4～7]报道了利福平(RIF)耐药实时荧光定量核酸扩增技术，即Xpert Mtb/RIF 技术在肺结核和肺外结核诊断方面的应用。本研究采用Xpert Mtb/RIF技术对部分结核性脑膜炎、疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中的Mtb进行检测，同时用抗酸染色涂片和培养法对受检标本标本进行检测，并对检测结果进行对比分析，探讨Xpert Mtb/RIF技术在结核性脑膜炎诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 研究对象为2014年4月～2016年4月西安医学院第二附属医院收治的结核性脑膜炎患者34例、疑似结核性脑膜炎患者43例、非结核性脑膜炎患者20例，其中男63例、女34例，年龄13～79岁。 结核性脑膜炎的诊断标准[8]：既往有结核病病史，急性或亚急性起病，慢性迁延性病程，出现头痛、呕吐等颅内压增高症状和脑膜刺激征，脑脊液压力明显增高、淋巴细胞增多、氯化物和糖含量减低，影像学检查见颅底脑膜及侧裂池呈点状或团块状明显强化，伴有脑积水等改变。43例疑似结核性脑膜炎患者包括脑梗死13例、癫痫9例、脑积水6例、脑炎15例。20例非结核性脑膜炎患者包括病毒性脑膜炎8例、化脓性脑膜炎12例。

1.2 脑脊液Mtb检测及药敏试验方法 所有受检者于治疗前留取脑脊液，分别用抗酸染色法、培养法及Xpert Mtb/RIF技术检测Mtb，培养出的菌株做RIF平药敏试验。

1.2.1 Mtb检测 ①抗酸染色镜检Mtb：采用离心浓缩法[9]处理脑脊液，脑脊液标本静置2～4 h，取沉淀部分30 mL并置50 mL的无菌螺旋盖离心管中，3 000 g离心20 min。弃上清，取沉淀物涂片。自然干燥，用火焰固定2～3次。采用萋尼抗酸染色法染色(萋尼氏染色液购自中国珠海贝索生物技术有限公司)并于镜下观察结果。根据涂片Mtb含量的多少[9]判为4+、3+、2+、1+、1～8条/300个视野、阴性6级(其中前5级判为阳性)。②培养法检测Mtb：采用中和离心法[9]处理脑脊液，脑脊液标本静置2～4 h，取沉淀部分30 mL并置50 mL的无菌螺旋盖离心管中，3 000 g离心20 min。弃上清，保留重悬沉淀物于5 mL灭菌生理盐水中，加入1～2倍体积的4% NaOH消化液，涡旋振荡30 s，静置15 min后在生物安全柜内打开螺旋盖，加入磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.067mol/L)至40 mL，3 000 g离心20 min，弃上清，加入1～2 mL磷酸盐缓冲液，混悬，接种。接种时以无菌吸管吸取上述处理液0.1 mL，均匀接种在2支罗氏培养基(购自中国珠海贝索生物技术有限公司)斜面上，保持斜面水平向上37 ℃培养24 h后，直立放置37 ℃继续培养。接种后第3、7天观察培养情况，此后每周观察1次，并在分离培养结果记录本上记录Mtb生长结果。根据菌落生长占培养基斜面的比例[9]分为++++、+++、++、+、实际菌落数、阴性6级(其中前5级判为阳性)。③Xpert Mtb/RIF技术检测Mtb：Gene Xpert Dx仪器、 Gene Xpert Mtb/RIF Cartridge检测盒及SR(sample reagent)购自美国Cepheid公司。取1 mL脑脊液标本加入前处理管中，然后加入2倍标本体积的SR标本处理液，涡旋振荡15～30 s，静置15 min，使标本充分液化。打开反应盒，取2 mL处理后样品由加样孔缓慢加入反应盒，然后将反应盒放入检测模块，仪器开始进行自动化检测。反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察结果。GeneXpert Mtb/RIF系统以Mtb DNA拷贝的高低分为高、中、低、极低和未检出5级(其中前4级判为阳性)。

1.2.2 药敏试验及菌种鉴定 药敏试验所用培养基均购自中国珠海贝索生物技术有限公司。采用比例法[11]。用接种环取一环培养基上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对制成1mg/mL菌悬液，梯度稀释为10～2 mg/mL和10～4 mg/mL，接种到含RIF(40 μg/mL)的罗氏固体培养基和空白对照管培养基，37 ℃培养4周，观察结果。每批药敏试验用H37Rv作为敏感对照，以评价含药培养基质量；若对照培养基上生长的菌落数少于20个，则重复试验。菌种鉴定与药敏试验同时进行，将1 mg/mL的菌悬液进行100倍稀释，接种0.1 mL于对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鉴别培养基上，37 ℃培养4周后观察结果。耐药百分比=(含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的的菌落数)×100%，耐药百分比lt;1%为受试菌对该药敏感、≥1%为受试菌对该药耐药。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。率的比较用χ2检验、校正χ2检验和确切概率法。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

34例结核性脑膜炎患者的脑脊液用抗酸染色法、培养法、Xpert Mtb/RIF技术检测到Mtb者分别为1、2、8例，阳性率分别为2.94%、5.88%、23.53%；抗酸染色法与培养法检测阳性率相比，χ2= 0.00，Pgt;0.05；培养法与Xpert Mtb/RIF技术检测阳性率相比，χ2=4.22，Plt;0.05；Xpert Mtb/RIF技术与抗酸染色法检测阳性率相比，χ2=4.61，Plt;0.05。

43例疑似结核性膜炎患者的脑脊液用抗酸染色法、培养法、Xpert Mtb/RIF技术检测到Mtb者分别为0、1、6例，阳性率分别为0、2.33%、13.95%；抗酸染色法与培养法检测阳性率相比(确切概率法)，P=0.5；培养法与Xpert Mtb/RIF技术检测阳性率相比，χ2=2.49，Pgt;0.05；Xpert Mtb/RIF技术与抗酸染色法检测阳性率相比，χ2=4.48，Plt;0.05。

20例非结核性脑膜炎患者的脑脊液用抗酸染色法、培养法、Xpert Mtb/RIF技术均未检测到Mtb。

34例结核性脑膜炎患者、43例疑似结核性膜炎患者、20例非结核性脑膜炎患者脑脊液用抗酸染色法、培养法、Xpert Mtb/RIF技术检测到Mtb者分别为11、7、0例，阳性率分别为32.35%、16.28%、0；结核性脑膜炎与疑似结核性膜炎患者相比，χ2=2.74，Pgt;0.05；疑似结核性脑膜炎和非结核性脑膜炎患者相比，χ2=2.20，Pgt;0.05；结核性脑膜炎与非结核性脑膜炎患者相比，χ2=6.25，Plt;0.05。

所有受检对象的脑脊液通过培养，3例发现阳性菌株，菌种初步鉴定均为Mtb，比例法药敏试验结果均为RIF敏感。同时，3例经过Xpert Mtb/RIF技术检测为RIF敏感。二种方法检测结果一致。

3 讨论

由于结核性脑膜炎患者病情轻重程度不同、就诊阶段不同、临床表现多样，加之脑脊液实验室检查特征性结果较少，导致确诊结核性脑膜炎的难度较大。因此，脑脊液中检测出Mtb仍然是确诊结核性脑膜炎的金标准和重要手段。目前，用于结核性脑膜炎诊断的方法有脑脊液抗酸染色法和培养法，前者容易漏检，后者出结果时间长(1～2个月)。随着分子生物学手段的不断发展，越来越多的新诊断技术应用于临床，Xpert Mtb/RIF技术便是其中之一。该技术只需手工加入已处理的待测样本，其余均由仪器自动操作判读是否为Mtb及其是否对RIF耐药，整个流程仅需 2 h。本研究利用Xpert Mtb/RIF技术检测结核性脑膜炎患者的脑脊液标本，并与传统的抗酸染色法、培养法相比较，探讨其在结核性脑膜炎诊断中的应用价值。

Xpert Mtb/RIF检测技术是一种半巢氏实时荧光定量PCR体外诊断技术，可对Mtb以及其RIF耐药性进行检测。该技术针对Mtb的rpoB基因81bp的RIF耐药决定区序列设计引物、探针，可以检测rpoB基因是否发生突变，从而判断受检标本是否对RFP耐药[9]。据报道[10]，通常需Mtb达5 000 CFU/mL时抗酸染色法才能得到阳性结果，Xpert Mtb/RIF技术的临床检出限为131 CFU/ mL[11]。在本研究中，采用Xpert Mtb/RIF技术检测结核性脑膜炎与疑似结核性脑膜炎患者的脑脊液，Mtb阳性检出率分别为23.53%、13.95%，均高于抗酸染色法(2.94%、0)和培养法(5.88%、2.33%)的检出率，与邹月丽等[12]报道确诊结核性脑膜炎组的23.68%和可能结核性脑膜炎组的18.18%接近。所有受检者Xpert Mtb/RIF技术阳性检出率为14.43%(14/97)，低于Tortoli等[7]报道的84.6%，其原因可能有以下几点：①入选者脑脊液标本本身含菌量较低；②脑脊液标本中存在某些抑制因子；③入选的病例数较少。

本研究中有3例脑脊液培养阳性，菌种初步鉴定均为Mtb，比例法药敏试验和Xpert Mtb/RIF技术监测均显示其对RIF敏感，结果一致率为100%，高于笔者之前的研究结果[13]。此次试验由于脑脊液标本数量有限，加之培养法阳性率较低，最终可以和Xpert Mtb/RIF技术检测结果作比较的RIF敏感/耐药的结果较少。

近几年，世界卫生组织及国家结核病参比实验室推荐了多种结核菌快速检测技术，如Xpert Mtb/RIF技术、CPA 恒温技术、LAMP 恒温技术等，使得结核病的诊断更加快速、准确、简便。这些技术对痰标本具有较高的诊断价值，对于含菌量较低的肺外标本更具临床意义。Xpert Mtb/RIF技术对Mtb的阳性检出率明显高于其他检测方法，大大提高了其病原学诊断率，具有特异性强、敏感度高、快速、简便，且能同时检测出Mtb是否对RIF耐药等特点，在结核性脑膜炎的诊断和治疗中具有重要的应用价值，可在资源丰富的地区作为一种常规方法大力推广，使其在肺外结核病的诊疗中发挥重要作用。

[1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.2016中国卫生和计划生育统计年鉴[M].北京：中国协和医科大学出版社，2016:250．

[2] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J]. 中国防痨杂志，2012，34(8)：485-508．

[3] Janvier F, Mérens A, Fabre M, et al. Tuberculous meningitis:diagnosis and therapeutic difficulties[J].Ann Biol Clin(Paris), 2010,68(3):355-361．

[4] Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance[J]．N Engl J Med，2010，363(11)：1005-1015．

[5] 张治国，欧喜超，孙倩，等．利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究[J]．中国防痨杂志，2013，35(1)：13-16．

[6] Hillemann D, Rüsch-Gerdes S, Boehme C, et al. Rapid molecular detection of extrapulmonary tuberculosis by the automated GeneXpert MTB/RIF system[J]. J Clin Microbiol ，2011，49(4)：1202-1205．

[7] Tortoli E, Russo C, Piersimoni C, et al. Clinical validation of Xpert MTB/RIF for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis[J]. Eur Respir J ，2012，40(2)：442-447．

[8] 吴江，贾建平．神经病学[M].3版．北京：人民卫生出版社，2016：234．

[9] 赵雁林，刘志敏.结核病实验室标准化操作与网络建设[M].北京:人民卫生出版社，2013，227-280．

[10] 崔鲂，夏云，张莉萍，等．生物芯片法在结核分支杆菌检测中的应用价值探讨[J].重庆医学，2009，38(19)：2411-2412．

[11] Helb D， Jones M， Story E， et al．Rapid detection of Mycobacteri-um tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand，near-patient technology[J]. J Clin Microbiol, 2010，48(1):229-237．

[12] 邹月丽，孙伟，郭力，等.Xpert MTB/RIF对结核性脑膜炎的早期诊断价值[J].中国综合临床，2015，31(9)：782-784．

[13] 李妍，张天华，鲜小萍，等.利用Xpert MTB /RIF 检测结核分枝杆菌及利福平耐药性的研究[J].临床肺科杂志，2016，21(10)：1762-1765．

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.019

R529.3

B

1002-266X(2017)43-0061-03

陕西省社会发展科技攻关项目(2016SF-272)。

闫菊娥(E-mail： 55709810@qq.com)

2017-05-31)