羊驼毛色形成分子调控研究进展

李佳晟，孙晓江，白瑞，范瑞文

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

羊驼毛色形成分子调控研究进展

李佳晟，孙晓江，白瑞，范瑞文

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

羊驼是唯一一种毛纤维颜色丰富、含22种天然色的毛用型经济动物。羊驼毛色表型取决于皮肤和毛囊黑色素细胞产生的黑色素以及黑色素运输到周围角化细胞的种类和数量，主要由遗传基因决定。近年来，对羊驼毛色形成的分子机制进行了较为系统的研究，发现了细胞内多个毛色相关基因及其分子路径以及细胞外对色素生成的相关作用因子。对调控羊驼毛色的关键基因以及miRNAs调控毛色的研究进行了综述。

羊驼；毛色；黑色素；调控基因；miRNAs

羊驼（alpaca）源于南美洲的安第斯山脉，是骆驼科的毛用哺乳动物，毛纤维质地柔软，长而细，弹性和韧性强，有“软黄金”的美誉。现在主要分布在海拔高度为4 200 m的秘鲁、玻利维亚、智利、阿根廷以及澳大利亚，少数分布在厄瓜多尔、美国、加拿大、日本和中国。自2002年Huacaya羊驼被引入我国以来，其已成功进行繁育，并建立了稳定的遗传品系。

毛色是脊椎动物最先被发现的表型特征之一，可用于鉴别动物亚种（或品种）[1]。羊驼的毛色是其重要的经济性状之一，具有从白色到黑色22种天然毛色。近年来，围绕羊驼毛色形成的分子机制进行了相关研究，逐渐发现了毛色形成机制调控网络，有助于建立羊驼等毛用型经济动物毛色遗传修饰新途径。

1 毛色与黑色素的生化生成

羊驼毛色丰富，主要与其复杂的调控基因密不可分，黑色素在其中扮演关键角色，其主要控制黑色素细胞的发育和黑色素的生成、运输2个途径。黑色素是一种多功能的生物聚合物，由真黑素（不含硫原子且难溶）、褐黑素（含硫原子且易溶于碱）混合的形式表示[2-3]。羊驼毛囊内的黑色素细胞产生的黑色素的质和量决定其毛色。黑色素母细胞是原始的黑色素细胞，由胚胎神经嵴细胞发育而成，在后期向表皮移动并分化为前黑素细胞，黑色素母细胞和前黑色素细胞均不能生成黑色素。只有当黑色素细胞成熟之后才能生成黑色素。L-酪氨酸的生成在黑色素生成早期是强制性的，且有限速作用。许多研究表明，黑色素细胞内酪氨酸酶催化机体内的酪氨酸发生羟化并启动相关反应以生成黑色素。酪氨酸酶能催化酪氨酸形成无色的多巴色素，多巴色素经过羟化、脱羧、催化氧化等反应，最后形成真黑素。在后面反应中如有半胱氨酸的参与，则产生Cys-多巴和Cys-多巴醌，同样通过关环、脱羧等反应，最后生成褐黑素。

2 羊驼毛色关键调控基因

2.1 羊驼黑色素生成中的关键限速酶——TYR，TYRP1和DCT

酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是黑色素生成过程中的关键酶，具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶2种活性[4]。作为黑色素生成过程中不可或缺的启动因子，TYR的活性与表达量直接决定着黑色素的产量和生成速度[5]，较高水平的TYR有利于黑色素的生成[6]。酪氨酸酶相关蛋白-1（Tyrosinase-related protein 1，TYRP1）和酪氨酸酶相关蛋白-2（Tyrosinase-related protein 2，TYRP2，DCT）均各自催化特异性反应。研究认为，外源性的TYRP1和DCT的表达均能上调TYR的活性，促进黑色素的生成。TRR，YPRP1，TYRP2这3种蛋白存在的同源性为40%，其基因一同构成酪氨酸酶基因家族[7]。白瑞等[8]研究发现，TYR基因在第10代羊驼黑色素细胞的表达量相当于第3代细胞表达量的25倍。试验结果表明，不同浓度的L-酪氨酸作用于羊驼黑色素细胞后，可使得TYR的mRNA的表达量显著变化，而且发现较低浓度的L-酪氨酸会提高TYR的mRNA表达量，而较高浓度的L-酪氨酸反而会使酪氨酸酶的mRNA的表达量降低，证明L-酪氨酸对酪氨酸酶具有一定制约关系[5]。

2.2 羊驼黑色素生成的重要转录因子——MITF

3 调控黑色素生成的分子信号通路

3.1 cAMP信号通路

3.1.1 CREBcAMP应答元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一种真核生物细胞核内蛋白，它的功能主要是调节基因转录，故称为调节转录的核因子。CREB具有调节转录功能，同时受到自身磷酸化作用的调控，该作用具有区域依赖性[14-15]。当前已知，CREB是许多蛋白激酶的磷酸化底物，在这些激酶中，最早被确认的一种是PKA。张俊珍等[16]通过实时荧光定量PCR发现，CREB1基因在棕黑色羊驼皮肤中的表达量是其在白色羊驼皮肤中的表达量的2.997倍。CREB1基因在羊驼黑色素细胞内是MITF预测分值最高的靶基因结合位点。

3.1.2 MC1R成熟黑色素细胞表面共有5种类型的黑色素皮质素受体[17]，其中，黑色素皮质素受体-1（Melanocortin-1 receptor，MC1R）属于G蛋白偶联受体超家族。MC1R具有7个跨膜结构域，被α-MSH视为天然受体[18]。任玉红等[19]研究发现，在棕色和白色羊驼皮肤表皮、毛囊周围外根鞘组织、毛球周围以及真皮乳头均有MC1R蛋白表达，但棕色羊驼主要在毛球顶部及表皮呈强阳性着色，而白色羊驼在相同部位呈弱阳性。MC1R基因在棕色羊驼皮肤中的基因表达量是白色羊驼的4.32倍，二者间差异极显著。

3.1.3 Lpa-miR-nov-66Lpa-miR-nov-66可与sGC基因的CDS区域进行结合，升高sGC基因表达量，调控升高cGMP含量，继而使cAMP含量降低，从而通过cAMP信号通路作用于MITF基因，下调黑色素的生成量[20]。

3.1.4 miR-324-3p曾庆宝等[21]经miR-324-3p调控MC1R基因影响黑色素形成的研究，发现通过转染过表达miR-324-3p能够调控MC1R的表达，下调MC1R导致下游MITF，TYR，TYRP2的基因表达下调，羊驼黑色素细胞黑色素的生成即受到抑制。

3.2 MAPK信号通路

3.2.1 KIT受体酪氨酸激酶（KIT）基因为表达黑色素细胞前体物，是干细胞生长因子受体，该受体是酪氨酸激酶受体家族成员之一。在羊驼毛囊中，有色羊驼毛囊结构中的KIT阳性强度高于白色羊驼，KIT在有色羊驼毛根成形部呈强阳性，毛根永久部有少量表达。在白色羊驼毛根永久部有较强的阳性反应，但在毛球部几乎不表达。KIT在有色羊驼皮肤组织中的相对表达量是白色羊驼的1.2倍[22]。3.2.2miR-193b张丹丽等[23]研究了在白色和棕色羊驼皮肤中miR-193b及其靶基因KIT的表达情况，结果发现，白色羊驼中KIT显著表达，而棕色羊驼中miR-193b显著表达，可推断miR-193b可能通过负调控KIT基因而促进黑色素的生成。

3.3 Wnt信号通路

步骤4：进行特征值分解，然后依据信号子空间和噪声子空间的正交性，进行谱峰搜索，最终得到DOA估计结果.

3.3.1 β-cateninβ-连环蛋白（β-catenin）是一种广泛分布且功能多样的蛋白质，具有高度保守的特点，处于Wnt信号通路下游，能够影响细胞的黏着，具有细胞内信号和调节基因转录的作用。β-catenin诱导毛囊形态的发生和毛囊干细胞的增生分化，影响毛发周期。于秀菊等[24]研究发现，β-catenin基因在羊驼表皮、毛乳头和毛根鞘不同部位表达差异极显著，并发现棕色羊驼皮肤中表达量显著高于白色羊驼皮肤，印证了β-catenin基因在黑色素合成过程中起到了调控作用。

3.3.2 Wnt3aWnt家族基因编码分泌性蛋白，目前主要有19种Wnt蛋白。Wnt3a蛋白属于分泌型生长因子[25]。宋云飞等[26]研究发现，Wnt3a基因在棕色羊驼中的表达量明显高于白色羊驼。Wnt3a在羊驼毛囊毛球部和根鞘都存在阳性反应物，不同毛色羊驼表达量差异显著。Wnt3a基因在黑色素细胞中升高β-catenin的表达量，继而调控MITF基因的表达量，最终调控黑色素的生成量。

3.4 TGF-β信号通路

3.4.1 TGF-β1转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）有3个不同的家族成员，分别是TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3。TGF-β是一种多功能性的生长因子，在损伤修复、脏器纤维化、炎症性疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病等发生发展过程中具有显著作用。贾小云等[27]通过qRT-PCR分析发现，TGF-β1 mRNA的表达量在白色羊驼皮肤组织中明显低于棕色羊驼，说明TGF-β1可能与黑色素的合成具有一定关联。

3.4.2 miR-663贾小云等[28]研究miR-633靶向TGF-β1调控羊驼黑色素细胞色素生成中发现，miR-633能够抑制TGF-β1的表达，影响TGF-β信号通路，抑制黑色素细胞中的黑色素的生成。

4 细胞外作用因子对黑色素生成的影响

4.1 α-MSH

α-黑素细胞刺激素（α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH）是一种神经内分泌激素。α-MSH与黑色素细胞表面受体MC1R结合，可使细胞内cAMP水平升高，继而使TYR基因的表达量升高、活性加强，最终促进黑色素的生成，并可优先刺激真黑素的生成。同时对维持和调节黑色素细胞的增殖、树突形成起着关键的调控作用。于志慧等[29]研究发现，在羊驼黑色素细胞中体外添加一定浓度的α-MSH能诱导树突增长、细胞增殖，同时细胞内MC1R，MITF和TYR基因表达量升高，促进黑色素生成。α-MSH与受体MC1R结合介导cAMP信号通路进而调节黑色素的生成。

4.2 IGF1

胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowth factor，IGF1）是由70个氨基酸组成的单链性多肽，其在细胞的增殖、分化、迁移等方面发挥重要作用。后续研究证明，IGF1是影响动物毛发生长发育和毛囊周期性变化的关键因子，其通过与受体IGF1R结合来发挥生物学作用。IGF1R是Ⅱ型TYR激酶受体家族的成员，对黑色素调控起到关键作用[30-32]。研究表明，添加适当浓度IGF1在体外培养的羊驼黑色素细胞中，可使MITF，TYR，TYRP2基因的表达量显著上调，进而促进黑色素的生成，同时提高了黑色素细胞增殖与迁移能力。当添加浓度为10 ng/mL时，作用最为显著[33]。

4.3 END-1

内皮素（Endothelin，END）是一种由内皮细胞生成的生物活性肽，由21个氨基酸组成，其具有3种异构体（END-1，END-2，END-3）。它广泛存在于包括皮肤在内的大部分组织，是一类促分化剂和细胞生长因子，对细胞内有丝分裂起促进作用。研究发现，内皮素可促进黑色素细胞的成熟与分化[34]。耿建军等[35]发现适当浓度的END-1可促进羊驼黑色素细胞增殖、树突增长，并上调细胞内TYR，TYRP1和EDNRB基因表达量，最终使黑色素生成量增加。

4.4 END-3

适当浓度的外源内皮素3（END-3）通过G蛋白偶联内皮素受体B（ENDRB）与KIT信号通路共同作用，可使黑色素细胞中TYR和MITF的mRNA与蛋白水平的表达量上调，使黑色素生成量增加[36]。

4.5 TGF-β3

研究发现，体外培养的黑色素细胞中添加适当浓度的TGF-β3，可促进黑色素细胞突触的形成，确保黑色素的运输。添加不同浓度的TGF-β3，可使MITF，TYR，TYRP2基因在mRNA水平和蛋白水平均不同程度下调，导致黑色素细胞中黑色素的生成量减少[37]。

5 结语

近年来，围绕羊驼毛色形成的分子机制进行了相关研究，先后发现了决定羊驼毛色的关键基因、cAMP/Wnt/TGF-β/MAPK的4条信号转导通路中的关键分子以及细胞外作用因子，同时调控黑色素生成的分子网络正在逐步形成。

随着消费水平的逐渐提高，人们对色彩多样的服装的需求量也越来越大。动物毛纤维作为人类纺织业重要的原材料，对其质量和数量上均提出较高的要求。然而当今社会绚丽多彩的纺织品主要是通过化学染料的方法来实现的，这类纺织品对身体健康和社会环境均有一定影响，因此引起社会各界的关注，如今更多的人们提出纯天然、多色彩毛纤维来替代化学染料。如果可以通过人工干预动物毛色基因的表达从而改变动物毛色，必将产生巨大的经济价值和社会影响力，这也将是社会发展的趋势。

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Research Advances of the Molecular Regulation of Hair Color Formation in Alpaca

LI Jiasheng，SUNXiaojiang，BAI Rui，FANRuiwen
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Alpacas,which are the economic hair-producing animals,have 22 natural hair colors.The phenotypes of hair colors are closely determined by the types and amount of melanins produced in melanocyte and transferred to the keratinocytes around,which are mainlydecided bythe genes.For many years,our team has been devoted to the research ofthe molecular regulation ofhair color genes of alpacas.To date,we have found a fewof hair color related genes and its pathway.This paper summarized the advance of the molecular pathwayofhair color related genes and miRNAs.

alpaca;coat color;melanin;regulation gene;miRNAs

S829.9

：A

：1002-2481（2017）06-1044-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.44

2017-03-17

山西省“三晋青年学者”人才专项

李佳晟（1995-），男，山西沁水人，在读本科，研究方向：动物毛色的形成机制。范瑞文为通信作者。