自体动脉血建立大鼠脑出血模型技巧

徐天策，郑胜哲

自体动脉血建立大鼠脑出血模型技巧

徐天策，郑胜哲*

（延边大学附属医院神经内科，吉林 延边 133000）

目的：探讨自体动脉血脑内注射法建立大鼠脑出血模型的技巧。方法：采用自体动脉血脑内注射的方法，通过立体定向仪，将120只Wistar大鼠从尾动脉中提取的50 μl自体不抗凝动脉血注入大鼠尾状核制成大鼠脑出血模型，通过行为学观察，评价模型建立的稳定性。结果：通过Longa评分法评价大鼠行为学，成功率为89.2%。结论：通过精准定位、定时以及对大鼠全程生命体征维持等制作技巧使大鼠脑出血模型成功率达89%以上。

自体动脉血；脑出血；动物模型

脑出血是临床常见的致死、致残率较高的疾病，严重威胁人类的健康。建立稳定性高、与人类脑出血相似程度高的实验性脑出血动物模型对研究脑出血的实验研究必不可少。目前，大鼠脑出血模型的制备方法主要为胶原酶诱导脑出血模型和自体动脉血脑内注入建立脑出血模型，前者由于无法控制出血量和出血部位，而且出血性为渗出性，与人类脑出血相似程度较后者低，故本实验整体上参考 Hua、Yang、Lee等［1-3］的方法，注血采用周中和等［4］的二次注血/退针法，通过立体定位仪，将大鼠的自体不抗凝动脉血注入大鼠尾状核部建立脑出血模型。近年来我们在粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对脑出血大鼠模型抗炎作用机制研究实验中进行了大量自体动脉血注入制作脑出血模型，现根据实践经验并结合相关文献，归纳整理出自体不抗凝动脉血注入建立脑出血模型的一些制作技巧及体会。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取成年雄性Wistar大鼠120只，体重250～300 g（由延边大学动物实验中心提供）。

1.2 主要仪器 脑立体定位仪、100 μl微量注射器、牙科钻（深圳瑞沃德公司生产），大鼠断头器，动物手术器械，无菌消毒巾等。

1.3 大鼠脑出血模型制作过程 新鲜配制的10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后头部备皮，俯卧位固定于立体定位仪上，调节立体定位仪，将大鼠门齿固定于门齿钩上，使前后囟位于同一水平线，调节耳间线，当听到耳杆穿破鼓膜的破裂声后，固定耳杆使大鼠头部无法移动［5-6］，将大鼠头部皮毛消毒后正中切开皮肤，3%双氧水剥蚀骨膜，暴露前后囟门及冠状缝，于前囟后0.2 mm，中线旁开3 mm处，用牙科钻钻开一个直径大约1 mm的小孔［7］，不伤及硬脑膜及脑组织。用40℃温水加热清洗鼠尾，待充血后乙醇消毒，剥离尾动脉，使用微量注射器取不抗凝动脉血50 μl固定在定位仪上，将微量注射器通过孔洞进针至6 mm尾状核部，采用两次自体动脉血注入法［4-8］，先将动脉血匀速注入 10 μl，停止注血 2 min，然后再次均匀缓慢的将动脉血注入40 μl，让针停留4 min，开始退针大约2.0 mm后再次停针4 min，之后可将注射器缓慢地完全退出，等待期间注意用无菌纱布包扎鼠尾止血，缝合切口后再用无菌棉球压迫止血。

1.4 观察指标 待大鼠清醒后进行行为学观察，采用Longa评分法［9］评价，0分：神经系统功能无缺损；1分：左前侧肢体不能完全伸直；2分：在大鼠行走时，出现转圈的现象；3分：在大鼠行走时，出现瘫痪侧肢体的倾倒；4分：不能自行行走，出现意识丧失的情况。本实验1～3分视为模型制作成功。评价后将大鼠用断头器断头取脑，清除血迹，去除大脑组织额极前部4 mm及嗅球部分，可见大脑右侧半球有注血孔，根据注血孔的位置将脑组织切割开，以冠状位的位置，观测血肿是否形成在尾状核［10］。

2 结果

制作的120例脑出血模型中，10只大鼠Longa评分1分，62只大鼠Longa评分2分，35只大鼠Longa评分3分；其余13只失败，其中1只为麻醉过程中死亡，考虑麻醉剂量过量，2只经切开取脑后证实动脉血未注入尾状核，2只术后感染死亡，5只Longa评分为0分，3只Longa评分为4分。模型制作成功率为89.2%。

3 讨论

3.1 术前注意事项 术前12 h禁食水，可使大鼠的血液变成高凝状态，血液较前浓缩，有助于血肿形成，并且可以防止麻醉期间返流、误吸；腹腔注射麻醉、头部皮肤切开及尾部动脉取血前必须做好消毒，以减少伤口感染机会，避免不必要的死亡。

麻醉药物尽量新鲜配制，存放时间最长不宜超过1周，剂量须按照动物体重计算，并严格避光配置保存，用避光注射器抽取药物，防止药物药效降低，造成第1次麻醉无法达到预期效果，反复多次注药，致死动物死亡，如需再次补充麻醉剂量不要超过初次的一半。

3.2 立体定位仪固定 准确固定是实验准确性的基础，稍有偏差血液将无法准确注入到大鼠尾状核，定位仪的门齿钩需与耳间线平面下方的2.4 mm处一致，这样就可以保证大鼠的前囟和后囟在同一水平线上［11］，耳间线的固定在实验开始既是难点，也是关键之处，将大鼠门齿固定在门齿钩应该在耳间线固定之后。位置固定精确后，固定的力度需要适量，保持大鼠头部无法活动的情况下，也不能太过用力影响大鼠呼吸。

3.3 取血及注血操作 先用肝素将微量注射器冲洗，防止抽血时因针管堵塞造成取血失败；用微量注射器取尾动脉血的过程要快，否则数十秒内血液就可能凝固，同时抽取血液时应细致匀速，避免有气泡产生，注射完毕后也应用肝素冲洗，避免下次使用时堵塞。本次实验初期使用蒸馏水清洗，后造成多只微量注射器堵塞，堵塞后强行推动针芯会使针芯弯曲影响后续实验。取血时尽量一次成功，多次取血会造成血管挛缩，血液凝固无法抽取血液。

在使用牙钻打孔时，钻孔力度要适度，可采取多次、点钻的方法，在感受到颅骨快穿透、未及硬脑膜时，可用微量注射器轻轻捅破，切不可暴力钻孔，否则极易损伤硬脑膜及脑组织，造成出血，影响实验的效果。

应尽量缓慢、匀速，有条件可使用微量注射泵注血，手动注血需采用点推进旋转注血，快速注血可能造成血液延针管返流，血肿形成不完全，或速度过快时颅压升高过快，血液破进侧脑室，流入蛛网膜下腔，实验效果达不到预期。

实验过程中需及时止血，用无菌纱布按压止血，尽量少使用过多棉球，防止大鼠失血过多死亡［7］，同时还应该注意维持大鼠体温，大鼠失血会造成体温下降，可使用动物保温垫来维持体温。

退针时须有停针时间，并且退针匀速，以保证血肿形成充分，否则可造成血液延针管回流影响实验效果。

全部实验操作时间尽量保证在40 min内完成，时间上与临床高血压脑出血过程相似，并且可避免大鼠从麻醉中清醒、或者休克死亡。

3.4 术后护理 大鼠术后勤换垫料，使垫料保持干燥、清洁，保证通风与适应的温度，于尾部及头部的创口可涂抹青霉素粉末［12］，防止感染，饲料、水分充足，有的大鼠术后偏瘫症状明显，可将饲料和水分放在旁边可触及的地方，以免行动不便的大鼠因饮食不顺利死亡。

综上所述，本实验通过相对较多的成功模型实例证实了使用大鼠自体动脉血脑内注入法制作大鼠脑出血模型是相对成熟且成功率较高，并且将近些年相关文献与此次经验相结合总结了一些实验技巧可显著提高实验成功率，避免不必要的失败，本次实验模型成功率为89.2%，与近些年文献报道造模成功率为71%～80%［13］的相同实验相比，成功率显著提高，对今后的相关实验具有借鉴意义。

［1］ Hua Y， Schallert T， Keep RF， et al.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Stroke， 2002， 33（10）：2478-2484.

［2］ Yang GY， Betz AL， Chenevert TL， et al.Experimental intracerebral hemorrhage： relationship between brain edema，blood flow，and blood-brain barrier permeability in rats［J］.J Neurosung，1994，81（1）：93-102.

［3］ Lee KR，Betz AL，Kim S，et al.The role of the coagulation cascade in brain edema formation after intracerebral hemorrhage［J］.Acta Neurochir，1996，138（4）：369-401.

［4］周中和，曲方，何祥，等.一种改良大鼠自体血脑出血模型：二次注血/退针法［J］.中国临床神经科学，2004，12（4）：406-408.

［5］Xi GH，Hua Y，Bhasin RR，et al.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage：effects of extravasated red blood cells on blood flow and blood-brain barrier integrity［J］.Stroke，2001，32（12）：2932-2938.

［6］ Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenaseinduced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（5）：801-807.

［7］朱文焕，周岱.大鼠脑出血模型制备的体会［J］.内蒙古民族大学学报，2009，15（5）：13-14.

［8］张波，温权，甘元华，等.两次自体动脉血注射法构建大鼠尾状核脑出血3模型的研究［J］.贵阳中医学院学报，2015，37（6）：19-23.

［9］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［10］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京：人民卫生出版社，1991：1-2.

［11］杨亚萍，刘晓鹏，台立稳，等.自体血注入法大鼠脑出血模型建立的制作技巧［J］.神经药理学报，2012，2（2）：29-31.

［12］李惠，娄季宇，杨霄鹏.大鼠脑出血模型制作技巧［J］.中国实用神经疾病杂志，2007，10（2）：152-153.

［13］张昊，马晓依，吕妍，等.大鼠脑出血模型［J］.中国医药指南，2012，10（34）：88-89.

The Skills of Establishing Intracerebral Hemorrhage Model in Rats by Injecting Autologous Arterial Blood into Caudate Nucleus

XU Tiance，ZHENG Shengzhe*
（Department of Neurology，Yanbian University Hospital，Yanbian 133000，China）

Objective：To investigate the skills of establishing intracerebral hemorrhage model in rats by injecting autologous arterial blood into caudate nucleus.Methods：The method by injecting of autologous arterial blood into caudate nucleus was used.Through a stereotaxic apparatus，50 μl autologous arterial blood from caudal artery was injected into the caudate nucleus to establish intracerebral hemorrhage model in 120 Wistar rats.The stability of the model was evaluated through behavioral observation.Result：The neurological behavior of the rats was evaluated with Longa score， and the success rate was 89.1%.Conclusion： This experiment improved the model's success rate by precise positioning， timing and maintenance of vital signs of rats，which will be helpful to increase the success rate of the model to more than 89%.

autologous arterial blood；cerebral hemorrhage；animal model

R743.3

A

1008-2344（2017）06-0495-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.011

国家自然科学基金资助项目（No.H0907）

郑胜哲（1969—），男（朝鲜族），博士，主任医师，研究方向：脑血管病及酒精中毒.E-mail：mikezheng23@163.com

2017-06-07

（文敏编辑）