转基因成分定量检测技术研究进展

杜智欣,焦 悦,张亮亮,朱鹏宇,付 伟,*

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100029;2.广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广西南宁 530021;3.农业部科技发展中心,北京 100125;4.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,海南海口 570311)



转基因成分定量检测技术研究进展

杜智欣1,2,焦 悦3,张亮亮4,朱鹏宇1,付 伟1,*

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100029;2.广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广西南宁 530021;3.农业部科技发展中心,北京 100125;4.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心,海南海口 570311)

转基因作物的种类以及含有转基因成分的产品在日益增长,转基因产品的安全性也越来越被社会公众广泛关注。世界各国均颁布转基因安全管理、标识法规,对转基因生物及其加工产品进行标识和管理。如何准确、稳定地对转基因产品中的转基因成分进行定量,已成为转基因产品检测技术研究的重要方向。本文综述了竞争性PCR、荧光定量PCR以及数字PCR等定量检测技术在转基因成分检测中应用及研究进展,讨论了目前各类转基因定量检测技术的优缺点,并在此基础上展望了定量检测技术在转基因成分检测领域的发展前景。

转基因,定量检测,PCR,数字PCR

基因工程的飞速发展使越来越多地转基因产品进入人们的日常生活。转基因产品食用和环境安全性的争议也越来越强烈[1-2]。包括欧盟国家在内超过60个国家地区以及国际组织已经制定了相关的法律法规[3],要求对转基因生物及其产品进行标识管理,用以维护消费者的知情权。

标识的阈值是指产品中含有的转基因作物的百分比。世界各国在设定转基因食品标识阈值时,除了考虑科学因素外,还要结合经济、社会、人文等因素,进而通过阈值来集中体现一个国家和地区对转基因安全风险的相应忍受程度[4]。其中,欧盟新颁布EC No 1829/2003和No 1830/2003中规定所有转基因成分含量超过0.9%的食品和饲料都必须进行强制性标识;澳大利亚、新西兰、以色列、捷克共和国、沙特阿拉伯等国家的阈值为1%;智利的阈值是2%;韩国、马来西亚等阈值为3%;日本、泰国、印尼、中国台湾等国家和地区规定的标识阈值为5%[5-6]。以美国为代表,加拿大、阿根廷等国家对于转基因食品的标识管理施行自愿性标识。中国目前采取的是零容忍的强制性标签制度,没有设定具体的阈值,只要是符合2002年颁布《农业转基因生物标识管理办法》中规定的5类17种转基因产品必须进行标识。但是不可否认,我国转基因安全管理实施定量标识和阈值管理是未来发展的必然趋势[7]。因此我国需提高定量检测技术水平以达到国际社会对转基因作物及其相关产品的检测水平。

标识制度不断发展和完善也促使转基因检测方法从定性到定量的发展,快速、灵敏、准确的定量检测技术已经成为转基因生物及其产品检测方法研究的重点,是安全管理和标识法规实施的技术支撑。目前在转基因定量检测过程中,由于核酸的稳定性要高于蛋白质,因此以核酸为靴标的检测技术成为定量转基因成分检测的首选技术。本文主要通过探讨定量检测技术在转基因检测领域方面的应用,旨在提出转基因定量检测技术未来发展的趋势和研究方向。

1 定量PCR检测技术在转基因产品定量检测中的应用

1.1 竞争性定量PCR检测技术

竞争性定量PCR(competitive quantitative PCR,QC-PCR)采用同目标DNA相同动力学特点和扩增效率的DNA模板(DNA竞争模板)与样品混合在同一体系中,使它们竞争反应体系中相同的底物与引物,同时以不同稀释梯度的竞争DNA模板建立标准曲线,再通过标准曲线可以计算待测DNA的含量[8]。该方法初期主要针对单一外源基因进行定量检测,如针对一代抗草甘膦大豆农达和玉米Bt11、Bt176品系建立了启动子和终止子的QC-PCR方法[9],以及Hardegger等建立了针对35S启动子和NOS终止子的竞争性PCR检测体系[10]。随后,QC-PCR方法经毛细管电泳激光诱导荧光技术(Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence,CE-LIF)进行检测,实现了玉米Bt176品系的双重定量检测[11]。Mavropoulou等[12]将PCR产物与微孔板中预先包被的靶基因杂交用以代替凝胶电泳可以同时检测转基因大豆的内源基因lectin与外源35S启动子,其中外源35S启动子的检测限可达24拷贝。此外,基于光谱自编码微球的高通量筛选技术也被引入QC-PCR检测体系中,并应用于转基因成分定量检测分析,可同时检测包含内源基因在内的4个靶基因,检测限可达500拷贝[13]。竞争性定量PCR实验原理巧妙而严谨,可以有效地降低实验室间的误差,进而得到较为可靠的定量结果,但是竞争性DNA制作工序复杂,需要进行反复测试进而达到一定的稳定性。同时每次实验都要针对检测目标的不同而做多种标准品对照,工作量大。此外,竞争性模板与目的模板扩增效率很难做到完全一致,这对实验结果的准确性会产生一定的影响。故此该方法受到初始标准品质量的影响非常大,如果不能把前期竞争性DNA制作转化为商业化运作,将很难适应日常大批量高通量的检测应用。

1.2 实时荧光定量PCR检测技术

实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR or Taqman PCR or qPCR)是现如今得到广泛认可和应用的定量PCR检测技术[14-15]。该技术建立在荧光能量传递技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)的基础之上,在PCR反应体系中加入非特异性荧光染料(如:SYBR Green I、Eva Green、LC Green和SYTO9等)或者特异性的荧光探针(如TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、Allglo探针、LNA、FRET、分子信标等),通过实时监测荧光量的变化,获得待测样品达到荧光检测阈值的循环数(cycle threshold,Ct值)。再根据已知浓度标准品的Ct值与其浓度对数成负线性相关关系这一原理,建立标准曲线。进而计算出样品中模板DNA的浓度[16]。Vaitilingom等[17]于1999年首次将该技术应用到转基因产品的定量检测上。近年来,实时荧光定量PCR被广泛应用于大豆[18]、玉米[19]、水稻[20]、番茄[21]、小麦[22]、棉花[23]、柑橘[24]等转基因植物的目的基因定量检测。同时,DNA提取技术的不断更新换代,促进了荧光定量PCR技术在深加工产品中的应用,如发酵豆制品[25-26]、粮油[27]、饲料[28]等。而随着规模化、实用化转基因技术的发展,多重扩增技术和实时荧光定量技术整合到一起,可对多个目的基因进行同时检测。但是在同一反应体系中,多对引物和探针之间存在相互抑制以及荧光通道的限制,目前建立的多是应用于转基因产品的筛选检测方法,Cottenet等针对47个检测目标的转基因成分最多可以做到24重实时荧光PCR筛选技术[29],而已报道的实时荧光多重PCR定量检测方法大多仅限于三重[30-31]。我国汪秀秀[32]采用锚定核苷酸探针(Locked Nucleic Acid,LNA)结合四个荧光通道(FAM、HEX、ROX和CY5)的实时荧光PCR扩增技术,建立了可以最多同时定量检测转基因棉花品系GHB119、T304-40、棉花内源基因ACP1与Cry2Ae蛋白基因的四重实时荧光定量PCR检测方法。不可否认经过多年的发展,实时荧光定量PCR已经是现阶段转基因产品定量检测方法中快速、高效、准确的代表。但从定量原理上来讲,实时荧光定量PCR对于目标DNA模板的定量主要分为绝对定量和相对定量两种。绝对定量是指用己知标准品制作的标准曲线来推算未知样品的模板量。相对定量则是指是在目标模板序列相对于另一参照样品序列的变化。不难看出,两种定量方法都极度依赖于标准品,故此针对现行商品化转基因产品大力开发标准物质并建立相关质量评估组织是保持该定量方法更为广泛应用的主要手段。另一方面,还有一些转基因产品没有经过任何批准混入市场。这些未知转基因产品中修饰DNA序列的相关信息一般由研究院所以及公司作为不公开信息保存,很难有针对性对其进行有效的检测,这将是现行主流定量检测发展的一个最大的挑战。此外,在实际检测过程中,由于荧光定量PCR体系较为封闭,耐受性差等因素,扩增阈值变化幅度较大,因此无论是准确度还是重现性在某些时候仍然存在误差较大的问题。

1.3 数字PCR定量检测技术

数字PCR(digital PCR,dPCR)是继普通PCR技术和荧光定量PCR技术之后的第三代PCR技术,是一项针对单分子目标DNA的绝对定量分析技术。该技术一般需要先将核酸模板稀释,并平均分配到几十至几万个单元中进行反应,理论上使每个反应单元中只有单个模板分子,然后在每个反应单元中独立地进行扩增反应。扩增结束采用泊松概率分布公式等统计学公式分析荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算初始样品中目标核酸的精确拷贝数[33-35]。相较于传统PCR,数字PCR的灵敏度很大程度上取决于反应单元的数目。反应单元的数目越多,数字PCR的灵敏度和准确度也越高。目前,根据反应单元形成的不同方式,商业化的数字PCR技术主要包括芯片式数字PCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)两类数字PCR系统。ddPCR源于乳液PCR(emulsion PCR)技术[36-37],主要由Bio-Rad和RainDance公司进行商业化开发,利用微滴发生器可以一次生成2万个纳升级(QX200TMDroplet Digital PCR System)或1千万个皮升级(RainDropTMDigital PCR System)的微滴。cdPCR则通过微流控等技术被均匀导入芯片上的反应仓或微孔中进行PCR反应,然后通过类似于基因芯片的方法扫描每个反应仓或者通孔的荧光信号,进而计算目的序列的含量。以Fluidigm公司的BioMarkTMHD System系统(1万～4万反应仓)以及ThermoFisher Scientific公司的QuantStudioTM3D Digital PCR System系统(2万微孔)为代表。

cdPCR和ddPCR这两类主流的商业化数字PCR技术都已应用于转基因成分定量检测。Burns等[38]利用cdPCR进行转基因样品含量分析并发现该平台检测限达到5拷贝;Pérez Urquiza等[39]应用Fluidigm与ThermoFisher两个公司cdPCR系统平台对玉米MON 810、大豆GTS 40-3-2、小麦DREB1A/acc1三个转基因品系进行对量分析。胡佳莹等[40]以转基因玉米MON863混合样品为例建立了基于单重和双重cdPCR体系的转基因样品含量分析方法。ddPCR在实际应用方面更为广泛,已在玉米[41-44]、水稻[45-46]、大豆[42,47]、深加工产品[48-49]中的转基因成分定量检测中进行验证。另一方面,dPCR特异性强、灵敏度高、稳定性好,是良好的计量平台。常被用作评估质粒标准品以及其他标准物质的转基因成分拷贝数比例[50-53]。数字PCR作为最新的绝对定量方法能准确定量单分子目标DNA,可以说该方法的出现,有效弥补了荧光定量PCR方法在定量检测方面高度依赖标准物质以及扩增效率不一致等不足,为转基因产品检测限量或阈值设定提供了新的度量标尺[54]。

但是,当前的数字PCR技术,无论是微滴还是芯片,由于内部设计精密和复杂的特征导致其每次检测成本极其昂贵,长期大规模使用费用太高,非一般实验室或者公司能够承受,这也是该方法不能普及的最主要限制因素。相信未来随着技术的不断更新,低成本的数字PCR产品被开发出来,应用范围会越来越广泛。

2 酶联免疫吸附法在转基因产品定量检测中的应用

酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是以抗原、抗体为基础的免疫学方法,通过特异性检测外源蛋白来定性、定量检测转基因产品。该方法借助于酶标仪可根据已知标注物质的一系列浓度梯度与吸光度值来制作标准曲线,以此确定样品中转基因蛋白的含量,但只能达到半定量检测的水平[55]。Roland等[56]早在1992年就将ELISA技术用于转基因植物中nptII基因表达产物的定量分析。白卫滨等[57]以抗草甘膦转基因大豆为材料,建立了检测表达CP4EP-SPS蛋白的ELISA定量方法。Kim等[58]采用ELISA检测技术对转基因胡椒中外源基因不同时间表达效率进行了定量比较研究。Kamle以及王新桐等分别针对转基因棉花Bt基因表达蛋白和nptII基因表达蛋白建立了双抗体夹心酶联免疫吸附定量检测方法[59-60]。

ELISA法具备酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性,同时还可以与PCR相结合,将PCR扩增产物与标记探针进行杂交,再与抗体特异性结合,并使底物显色,可以根据吸光值的标准曲线进行半定量分析,具有操作简单,费用低、特异性好,可实现高通量检测的优点。但ELISA法本身易出现本底过高,以及如保温时间的差异、洗涤方法不同等相关因素都有可能导致检测结果出现偏差,在实际操作中只能检测有限种类未加工的转基因产品[61]。

3 讨论与展望

转基因生物的安全性管理是一个全球性的问题,特别是随着经济全球化和国际贸易的不断发展,各个国家和地区在转基因产品的阈值范围、标识方式等管理制度上的差异已经成为转基因产品国际贸易中最主要的技术贸易壁垒之一[54]。因此,如何精确地对转基因产品中的转基因成分进行定量,在国际上推行统一含义的阈值,是许多国际组织努力的目标[62]。从定量的角度来看,基于外源蛋白质检测方法由于缺乏成熟转基因产品的内源蛋白作对照,不能精确测定转基因含量[63],此外,蛋白质基础上检测方法存在操作繁琐、稳定性差等缺点,比如说转基因深加工产品,由于经过高温,外源蛋白在加工过程中容易失活或分解,造成检测结果假阴性概率大大增加。因此以核酸为靴标的检测技术成为定量转基因成分检测的主要研究和使用的方法[64-65]。

PCR方法是目前最准确的应用于转基因植物检测的方法[66-68],定量PCR方法经历了竞争性定量PCR到荧光定量PCR以及现如今数字PCR的过程,其中竞争性定量PCR从严格意义上讲是一种半定量的方法,虽然对实验仪器的要求不高,但实验的关键技术需要利用基因重组技术构建标准竞争DNA,每次检测需要多个标准样品作对照[61],既不适合检测高通量的样品,同时对于一般实验室来说有很大难度。荧光定量PCR技术作为目前现行的转基因产品定量的核心技术而被广泛使用[70-71]。但是也不能忽视其方法应用的限制,该方法主要是依靠参照标准曲线和标准物质进行拷贝数定量分析[72],仅能实现相对定量分析,这就必然会受到标准物质发展以及质量评估建立滞后的限制[73],另外,荧光定量PCR对DNA模板纯度和PCR抑制因子等因素很敏感,在复杂体系中会导致定量的不准确[72],定量分析通量较低[48]。此外,实时定量PCR的定量并不够直接,它一般需要标准曲线来将含量转化为绝对的浓度,而这些浓度不同实验室间不确定度较大。实时定量PCR也难以检测那些微小的拷贝数目变化,灵敏度有限[74]。数字PCR不像荧光定量PCR技术需要全程收集荧光信号,而是分成两部分,前期PCR扩增和后期荧光信号分析,即在PCR终点进行荧光信号的检测和计数统计,整个过程既不依赖扩增曲线的循环阈值,也不需要标准物质的参与便可实现绝对定量检测,避免了因为复杂样品与纯的标准品之间核酸提取效率和扩增效率不一致而引起的偏差[48,50,75];同时数字PCR将传统PCR指数数据转换成数字信号,能减小普通定量PCR反应的影响因素[50,76],对样品DNA纯度的要求更低[38];灵敏度和重复性相对普通定量PCR都有较大提高[38,77-80]。

综上所述,转基因生物安全不断拔高的关注度以及阈值管理的不断完善直接推动着转基因检测技术由半定量到精确定量、绝对定量,检测效率及自动化程度越来越高。现阶段,荧光定量PCR技术在国内外转基因产品定量检测方法中仍然占主导地位,但是随着全球已商业化的转基因作物逐年增加,部分制定的转基因检测技术标准以及标准物质根本无法完全覆盖到所有的转基因作物品系,对于一些已研制出来即将通过安全认证的转基因新品种的检测,更是缺乏相关的序列信息和相关技术规程。因此,相对于转基因新品种及转化事件的不断增多,其针对性的背景信息收集和标准物质的发展则显得格外重要。另一方面,数字PCR在已经报道的转基因定量检测研究中表现出更高的灵敏度和稳定性,是未来转基因定量检测技术的发展趋势。

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Development of quantitative detection techniques of genetically modified organisms

DU Zhi-xin1,2,JIAO Yue3,ZHANG Liang-liang4,ZHU Peng-yu1,FU Wei1,*

(1.The Institute of Plant Quarantine,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100029,China;2.Guangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanning 530021,China;3.Science and Technology Development Center,MOA,Beijing 100125,China;4.Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570311,China)

The concern of public has been more and more focus on the safety of the Genetically Modified Organisms(GMO)as the rapid development of transgenic techniques and uncertain effect to human beings and environment. Different countries and organizations have declared kinds of safety and labeling laws to achieve the proper regulation to the commercialization of the GM products. In this manner,the achievement of stable and accurate quantitation of GMO content within different kinds of commercialized product has become the key point of the development of GMO detection techniques. In this paper,the application and development of different quantitative detection methods were summarized,such as competitive PCR,real-time PCR,digital PCR and etc. Meanwhile,the advantages and drawbacks of different detection methods were discussed and the future of the quantitative detection methods in the area of GMO content quantitation were predicted.

transgenic;quantitative detection;PCR;digital PCR

2016-10-18

杜智欣(1980-),男,博士,农艺师,研究方向:转基因生物安全,E-mail:57204302 @qq.com。

*通讯作者:付伟(1983-),女,博士,副研究员,研究方向:转基因生物安全,E-mail:fuwei0212@163.com。

TS201.2

A

1002-0306(2017)10-0379-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.065