环状RNA(circRNA)在肿瘤中的研究进展

鲁菱娇，张艳亮 综述；段勇 审校

引言

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种具有环形结构的特殊非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)。上世纪的70年代，人们在研究RNA病毒时发现了环状RNA[1，2]。然而，在circRNA被发现后的很长一段时间里，由于检测技术的限制，能检测出的circRNA量非常少，因此circRNA并未引起人们的重视。随着高通量测序技术的出现，人们通过测序检测到了各种生物体内表达的circRNA的数量实际上是非常庞大的，甚至超过相应线性RNA的10倍之多。

20世纪初，Salmena L等[3]提出了竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)假说，即各种类型的RNA转录物具有相同miRNA反应元件(miRNA response elements，MREs)， 可 竞 争 性 结合相同的miRNA，从而影响游离miRNA的表达水平，在转录后水平进行调控。两年后，Hansen TB等[4]提出circRNA具有类似于miRNA海绵的作用，其可吸附miRNA，从而影响所吸附miRNA对其靶mRNA的作用。由此我们可推导RNA家族中存在着互相调控的关系，即：circRNA→miRNA→mRNA。大量研究表明，miRNA在肿瘤发生、发展过程中具有重要的调控作用，而基于circRNA可吸附miRNA的功能，我们可猜测，circRNA在调控肿瘤的发生、发展过程中也具有不容忽视的作用。

1 circ RNA的结构、特征及功能

1.1 circRNA的结构、特征 cicrRNA不同于线性RNA，其大多是由编码蛋白基因的前体mRNA可变剪接产生的，ciricRNA的5'端和3'端直接头尾相接形成环状闭合结构，因此circRNA既无5'端的帽子结构，也无3'端的多聚A尾结构，因为缺乏自由端，因此不能被核酸内切酶降解，比线性RNA更稳定[5，6]。cicrRNA在真核生物中高度表达，稳定存在于细胞胞浆内，大多数由外显子序列构成[7，8]，也有少部分是由内含子序列构成，其种类具有跨物种保守性，其表达具有组织、时间特异性。

1.2 circRNA的功能 (1)circRNA可作为海绵吸附miRNA是circRNA第一个被认知的功能。在对circRNA 的研究中[4，5]，Memczak S 等提出 circRNA通过自身的miRNA反应元件(MREs)与mRNA竞争性结合miRNA，解除miRNA对靶mRNA的抑制作用，使靶mRNA的翻译得以进行，由此可见，circRNA可在转录后水平调控相应mRNA的表达水平[9]。

(2)circRNA可通过与其他RNA碱基互补配对进而调控其他RNA水平，例如，小脑变性相关蛋白1反义转录物 (antisense to the cerebellar degen-eration-related protein transcript，CDR1as) 能 与CDR1 mRNA互补配对，从而增强CDR7 mRNA的稳定性[10]。CDR1as可结合靶mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region，3′UTR)，抑制靶 mRNA 的作用，从而对其表达进行调控[5]。

(3)circRNA能与蛋白质结合，形成RNA-蛋白复合物，以此调节基因转录及蛋白的活性[4，5，11-13]，例如，CDR1as能与阿格蛋白(Argonaute，AGO)紧密结合[4，5]；Yang W 等[13]发现，circ-Foxo3 不仅具有吸附大量miRNAs的海绵样作用，circ-Foxo3还可与不同的蛋白相结合[10，14，15]。 由此可见，circRNA 既可以通过结合miRNA间接调控蛋白的功能，又可以通过直接与蛋白结合而影响蛋白的功能。

(4)circRNA也可以作为翻译的模板指导蛋白质的合成[16，17]，Wang Y 等[18]发现，在体外细胞实验中瞬时转入circRNAGFP，可以翻译成具有完整功能的GFP蛋白，并且这种蛋白可在瞬转后的几天内持续存在。

(5)circRNA能与pre-mRNA竞争，直接调控母基因表达[19]。在细胞核中，circRNA还可通过与RNA polyII相互作用，调控母基因的表达[19，20]。

2 circ RNA与肿瘤

circRNA因具有稳定、组织表达特异性等特性，因此更具有成为肿瘤标志物的潜力，其在肿瘤诊断、治疗方面的运用价值受到越来越多的关注。人们分别在肺癌、胃癌、肝癌等肿瘤中发现相应的特异性表达的circRNA。

2.1 肺癌 田芳等[21]对6株非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系进行研究后发现，circHIPK3在6株NSCLC细胞株中均有表达，其中H2170表达最高，H1299表达最低。当干扰circHIPK3时，明显抑制NCIH2170细胞增殖，而过表达circHIPK3可促进NCI-H1299细胞增殖。且过表达circHIPK3能够上调类胰岛素1号增长因子（insulin-like growth factors-1，IGF-1）的表达水平，干扰circHIPK3导致IGF-1表达水平下调。Zhu X等[22]用芯片筛选出肺腺癌组织中特异性表达的circRNAs，发现差异表达的circRNAs中上调的有39个，而下调的有20个，并进一步证实了hsa_circ_0013958在所有的肺腺癌患者的癌组织、血浆中均显著上调，他们还发现，hsa_circ_0013958的表达水平与肺腺癌的TNM分期及淋巴结转移相关，通过细胞功能实验发现，敲减hsa_circ_0013958后可促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭，并抑制细胞凋亡。此外，hsa_circ_00139 58还可发挥其海绵作用吸附miR-134，以此阻碍miR-134对cyclinD1的抑制作用，而cyclinD1在非小细胞肺癌的发展中具有重要作用。Yao JT等[23]对101位NSCLC患者的癌和癌旁正常组织进行circRNA_100876的表达验证，发现NSCLC患者的癌组织显著上调，且与NSCLC患者的淋巴结转移和肿瘤分期有关，他们提出circRNA_100876可能作为NSCLC潜在的生物学标志物或NSCLC的治疗靶点。

2.2 胃癌 Lai ZY等[24]对胃癌组织和癌旁组织差异表达的mRNA和差异表达的circRNA的检测，通过 分析发现 hsa_circ_0047905、hsa_circ_0138960和has-circRNA7690-15在胃癌组织中高表达，且在 胃 癌 细 胞 中 敲 减 hsa_circ_0047905，hsa_circ_0138960和 has-circRNA7690-15后，均可造成相应基因的表达下调，功能实验发现，在体外抑制这三种circRNAs可抑制胃癌细胞系的增殖和侵袭。这些均提示hsa_circ_0047905、hsa_circ_0 138960和has-circRNA7690-15可能在胃癌的形成过程中起到促进作用。Huang M等[25]首先在20对胃癌及癌旁正常组织验证hsa_circ_0000745的表达，发现hsa_circ_0000745在胃癌组织中下调，再扩大样本量分别验证60例胃癌患者的胃癌组织和血浆中hsa_circ_0000745的表达情况，发现无论在胃癌组织中还是血浆中，hsa_circ_0000745均出现下调，且与淋巴结转移有关，而通过ROC曲线证实血浆中hsa_circ_0000745与癌胚抗原CEA联合检测对胃癌具有良好的诊断价值。此外，也有证据表明 circular RNA LARP4[26]、hsa_circ_100269[27]、hsa_circ_0001895[28]在胃癌组织中出现下调，表明某些circRNA在胃癌的发展中具有重要作用。

2.3 乳腺癌 Zhang CL等[29]对两组不同泌乳时期的老鼠的乳腺组织进行circRNA种类的测定，发现不同泌乳期表达相同种类的circRNA仅占少数，而两个时期检测到circRNA种类大多数不同，表明在不同的泌乳期，circRNA的表达具有特异性，由此，研究人员推测，circRNA可为各种类型的乳腺癌的比较提供基础，且对于特定的乳腺癌或乳腺发育时期，我们都可以筛选出特异性的circRNA来进行检测。He R等[30]通过circRNA芯片筛选了三阴乳腺癌细胞系与人乳腺上皮细胞中差异表达的circRNA，发现circGFRA1在三阴乳腺癌细胞系中高表达，通过qPCR验证了circGFRA1在三阴乳腺癌细胞系和222例三阴乳腺癌患者样本中的表达情况，进行生存分析后发现高表达circGFRA1的预后更差，他们还发现敲减circGFRA1后可抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，预测分析结合荧光素酶报告实验发现circGFRA1与GFRA1均可结合miR-34a，且 circGFRA1与GFRA1的表达存在相互调控的机制。Yin WB等[31]通过对5例乳腺癌和健康志愿者对照组的外周血总circRNA的芯片分析，筛选出差异倍数超过2倍的circRNA分子有41个，其中19个上调，再通过扩大样本量对20例乳腺癌患者的血清进行qPCR验证和ROC曲线分析，发现hsa_circ_0001785可能在乳腺癌的诊断中有一定价值。

2.4 肝癌 Qin M等[32]对89对肝细胞癌和癌旁组织中的hsa_circ_0001649的进行分析，发现hsa_circ_0001649在肝癌组织中显著下调，此外，研究人员还发现，在肝细胞癌中，hsa_circ_0001649表达与肿瘤大小和肿瘤栓子的发生有关系，这些也提示了hsa_circ_0001649可能作为肝细胞癌的一个潜在的新的生物标志物，并在肝细胞癌的发生和转移中起到重要作用。Shi L等[33]运用高通量分析了肝癌细胞中雄激素受体（androgen receptor，AR）对circRNAs表达的影响，发现AR通过上调RNA编辑酶ADAR1 p100抑制circRNA的表达，AR转录因子结合到ADAR1的启动子区可上调ADAR1的表达，进一步调控下游circARSP91表达，circARSP91可分别在体内和体外抑制肝癌细胞的生长，他们还发现高表达ADAR1的肝癌患者预后不良并且与AR表达正相关，这表明了雄激素受体AR通过ADAR1抑制肝癌细胞中circRNA表达的分子机制，对肝癌的诊断和治疗具有潜在的意义。

2.5 宫颈癌 Wang H等[34]分析了3例HPV16感染诱发的宫颈癌和对应癌旁组织的全转录组，发现99种差异表达的circRNAs。Gao YL等[35]通过分析4对宫颈癌组织circRNAs芯片，筛选出45个高表达4倍以上的circRNAs分子，再进一步扩大样本量在35对宫颈癌样本中进行qPCR验证hsa_circ_001828的表达情况，发现hsa_circ_001828在宫颈癌组织中显著高表达，体内外实验均证明敲减hsa_circ_001828后可抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭迁移能力，此外，他们通过生物信息学预测及荧光素酶报告实验发现hsa_circ_001828可竞争性结合miR-497从而发挥原癌基因的功能。

2.6 大肠癌 Wang X等[36]设计不同的引物扩增hsa_circ_001988，并进行测序验证，认为hsa_circ_001988可能成为结直肠癌诊断的一种新的潜在的生物标志物并有望成为一个潜在的新的治疗靶点。

3 展望

circRNA的特异性结构赋予了其独特的功能，多项研究均发现circRNA参与肿瘤发生、发展、侵袭、转移等过程，作为ceRNA网络中不可缺少的信息分子，其在体内不仅调控肿瘤的发病过程，也广泛参与其他非癌症疾病的发病过程。目前已知，circRNA分子具有物种、组织、时序特异性，并且高度保守、稳定，这些特性提示我们，circRNA具有作为新一代肿瘤监测的特异性标志物的潜力；同时，circRNA可直接与miRNA、靶基因以及结合蛋白相互作用，在转录后水平进行调控，为靶向治疗肿瘤疾病提供了参考。目前，对circRNA在体内的作用机制的研究较少，虽然已经有研究证实某些circRNA与某些特定肿瘤相关，但将circRNA作为某种肿瘤特异性标志物，运用在临床诊断肿瘤上仍然需要进一步的探索。