肝癌患者CD8+CD28-Foxp3+调节性T细胞的变化及意义

2017-04-02方大正吴红伟武伦万光俊沈丰

中国普通外科杂志 2017年7期

方大正，吴红伟，武伦，万光俊，沈丰

（湖北医药学院附属东风医院肝胆外科，湖北十堰 442000）

调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）在T细胞亚群中具有重要免疫调节功能，它可以改变机体免疫内环境，和肿瘤细胞免疫逃逸与肿瘤形成密切相关[1]。目前，较为常用的特异性检测Tregs分子表面标记物的是CD8和CD28，基于CD8+CD28-Tregs的免疫活性调节，已成为目前肿瘤如黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌等免疫研究的热点[2-3]。但其在肝细胞癌（以下简称肝癌）临床分期、分化程度等方面报道不一[4]。叉状头/翼状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3）在胸腺和外周血CD8+CD28-Tregs中特异性表达，抑制机体增殖与活化肿瘤特异性T效应细胞，与机体荷瘤时的免疫抑制状态有关[5]。在T细胞亚群中，CD4+CD25+Tregs具有免疫负调控功能，在原发性肝癌患者中已有研究[6]。而CD8+CD28-Foxp3+Tregs在肝癌患者外周血中和肿瘤组织中研究较少[7]，本研究检测肝癌患者外周血和肿瘤组织中CD8+CD28-Foxp3+Tregs的水平，探讨其与肝癌的关系。基于上述认识，本研究应用流式细胞仪检测和分析肝癌患者外周血Treg细胞表面标记，观察肝癌和癌旁组织中CD8+CD28-Foxp3+Tregs的差异性，旨在为肝癌的免疫性治疗提供可能的实验基础。

1　材料与方法

1.1　研究对象外周血标本

72例肝癌标本均为湖北医药学院附属东风医院肝胆外科2014—2016年经术后病理确诊标本，术前均未经过放、化疗处理，术前取外周血；其中男51例，女21例；年龄41～72岁，平均（49.8±9.5）岁。72例肝癌标本按照国际抗癌联盟（International Union Against Cancer，IUCC）分期标准，高分化肝癌29例患者，中分化肝癌25例，低分化肝癌18例。22名正常对照者为同期我院健康体检中心志愿者外周血，其中男15例，女7例；年龄43～70岁，平均（48.6±9.2）岁，对照组均无急、慢性疾病史。两组均知情同意。

1.2　主要试剂和仪器

人调节性T细胞（T-reg）检测试剂盒包括：抗CD8-PE、CD28-FITC、Foxp3-PE、IgG1-PE、IgG1-FITC等购于美国BD公司；溶血素羊抗人Foxp3多克隆抗体购自美国Bioworld biotechnology公司（工作浓度1:200），即用型免疫组化兔抗羊二抗和3，3-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒均购自北京中杉金桥生物科技有限公司；溶血仪、FACS流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.3　流式细胞术检测外周血CD8+CD28-Fo xp3+Tregs

参照文献[8]，抽取入院1 d肝癌患者和健康体检者（对照组）外周血1 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。取血标本100 μL，分别加入IgGl-FITC、IgGl-PE、CD8-FITC、CD28-APC、Foxp3-PE各10 μL，室温下静置避光孵育15 min后，加红细胞裂解液1 mL溶解红细胞，震荡数秒并静置5 min后，离心1500 r/min×5 min。选取淋巴细胞群设门流式细胞仪检测Tregs，分析CD8+CD28-Foxp3+Tregs与CD8+T细胞比值。Cell Quest软件获取和分析数据，每个样本检测1×104个/次。

1.4　免疫组化检测肝癌组织中和癌旁组织中Foxp3阳性细胞

采用免疫组织化学SP法检测肝癌组织中和癌旁组织中Foxp3阳性细胞，严格按照免疫组化试剂盒说明书步骤进行操作。组织切片处理如下：常规取肝癌组织和癌旁10 cm以上组织，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，厚5 μm切片，脱水透明，柠檬酸钠煮沸，微波抗原修复，山羊血清封闭，滴加一抗，羊抗人Foxp3多克隆抗体4 ºC冰箱孵育过夜，次日PBS缓冲液洗涤后，滴加兔抗羊二抗，37 ºC孵育30 min，PBS缓冲液洗涤，DAB显色，镜检观察染色程度，苏木精复染细胞核，自来水返蓝，梯度酒精脱水脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察、摄片。Foxp3阳性细胞染色呈棕黄色或黄色颗粒，定位为胞质。每张切片任意选取高倍镜下5个视野，计数Foxp3阳性细胞，按照视场面积计算每mm3Foxp3阳性细胞数目。阳性细胞计数由与本研究无关的2位病理医师计算并确认取均值。

1.5　Western blot检测肝癌组织中和癌旁组织中Foxp3蛋白的表达

每例肝癌组织和相应癌旁正常肝组织约100 mg，加入1 mL组织细胞裂解液，冰上剪碎并研磨组织约30 min，研制成组织匀浆，放置于1.5 mL EP管中，4 ℃、离心12000 r/min ×30 min，取上清进行蛋白定量，蛋白浓度测定采取BCA法。100 ℃沸水煮沸变性5 min，取30 µg每个样本的总蛋白行SDS-PAGE电泳分离，转膜至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，1:1000稀释的羊抗人Foxp3多克隆抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗涤PVDF膜3次，室温下放入兔抗羊二抗（1:2000稀释）孵育2 h，ECL化学发光试剂显色曝光。以β-actin作为上样内参照，所得结果以灰度扫描并相对定量分析，用目的蛋白条带吸光度值/β-actin条带吸光度值表示Foxp3蛋白的相对表达强度。

1.6　统计学处理

实验所得数据采用SPSS 17.0软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析和SNK-q检验进行多组数据比较，t检验比较两组均数，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1　外周血CD8+CD28-Foxp3+Tregs/CD8+T细胞表达情况

流式细胞分析结果显示，外周血CD8+CD28-Foxp3+Tregs/CD8+T细胞表达在肝癌患者明显高于健康对照组（P＜0.05，P＜0.01），且随着肝癌患者分化级别的降低，CD8+CD28-Foxp3+Tregs/CD8+T细胞表达逐渐升高，但组间差异无统计学意义（图1）。

图1　肝癌患者和健康对照人群外周血CD8+CD28-Foxp3+Tregs/CD8+T检测结果　A：健康对照组；B：高分化肝癌组；C：中分化肝癌组；D：低分化肝癌组Figure 1　Detection of CD8+CD28–Foxp3+Tregs/CD8+T in peripheral blood of HCC patients and healthy population　A: Healthy control group; B: Well diあerentiated HCC group; C: Moderately HCC group; D: Poorly diあerentiated HCC group

2.2　CD8+CD28-Foxp3+Tregs表达与肝癌患者临床病理因素的关系

流式细胞分析结果与肝癌患者临床病理因素比较显示，CD8+CD28-Fxop3+Tregs/CD8+T的表达与性别、年龄无关（均P＞0.05），与TNM分期、有无淋巴结转移、肿瘤分化程度有关（P＜0.05）（表1）。

表1　肝癌患者外周血CD8+CD28-Fxop3+Tregs/CD8+T与临床病理因素的关系（%，±s）Table 1　Relations of peripheral blood CD8+CD28–Fxop3+Tregs/CD8+T with clinicopathologic factors of HCC patients(%, ±s)

因素　n　C D 8+C D 28-F o x p 3+T r e g s/C D 8+T　t 　P性别男51　8.43±1.18　0.604　0.582女21　8.39±1.20年龄（岁）≤55　39　8.41±1.32　0.862　0.427＞55　33　8.43±1.63 T N M分期I/I I　35　7.12±0.99　3.981　0.009 I I I/I V　37　8.01±7.46淋巴结转移有41　8.77±1.94　4.536　0.007无31　8.16±1.67分化程度高分化　29　7.96±1.63　3.627　0.042中、低分化　43　8.78±1.76

2.3　肝癌患者病理组织Foxp3阳性细胞检测

在肝癌病理组织中有Foxp3阳性表达，位于肝癌或癌旁正常组织的细胞胞质中。癌旁组织中Foxp3平均阳性细胞数为（7.26±1.97）个/mm2，高分化肝癌平均阳性细胞数目为（26.02±8.34）个/mm2，中分化肝癌平均阳性数目为（28.05±8.86）个/mm2，低分化为（31.65±8.15）个/mm2；与癌旁正常组织中Foxp3阳性细胞比较，肝癌组织中Foxp3阳性细胞数明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；但不同分化程度肝癌组织中Foxp3阳性细胞数比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

2.4　Foxp3蛋白在肝癌和癌旁组织中的表达

Foxp3蛋白在肝癌和癌旁组织中均有表达，但在肝癌细胞中的表达量明显高于癌旁细胞（图3）。由图像分析可知，与正常组Foxp3蛋白表达相比，肝癌组织中Foxp3蛋白的表达明显增强，差异有统计学意义（P＜0.01）；但不同分化程度的肝癌组织中Foxp蛋白表达间差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。

图2　免疫组化检测Foxp3阳性细胞（×400）　A：癌旁组织（距肿瘤边缘5 cm）；B：高分化肝癌组织；C：中分化肝癌组织；D：低分化肝癌组织Figure 2　Immunohistochemical staining for Foxp3 positive cells (×400)　A: Tumor adjacent tissue (5 cm away from tumor tissue);B: Well diあerentiated HCC tissue; C: Moderately diあerentiated HCC tissue; D: Poorly diあerentiated HCC tissue

图3　Western blot检测Foxp3蛋白的表达　1：癌旁组织；2：低分化肝癌组织；3：中分化肝癌组织；4：高分化肝癌组织Figure 3　Western blot analysis of Foxp3 protein expression 1: Tumor adjacent tissue; 2: Well differentiated HCC tissue; 3: Moderately differentiated HCC tissue;4: Poorly differentiated HCC tissue

3　讨　论

Tregs是影响肿瘤患者预后的潜在因素之一，目前，在肿瘤、转移淋巴结、外周血、恶性腹水，胸腔积液中均有发现[2-3]。手术、放疗和化疗是传统的肿瘤治疗手段，随着医疗水平的发展，对肿瘤的发病机制认识不断深入，在临床中，调动患者机体主动免疫功能，进行免疫治疗已逐步开展，但其临床上对肝细胞癌的疗效并不确定，可能与患者肿瘤抗原中正常细胞较多，机体T细胞免疫系统对癌细胞免疫“豁免”有关[4]。Tregs的相关研究如Tregs/CD3、Tregs/CD4、Tregs/CD8等在原发瘤和转移瘤中的比率已见于很多研究[4-7]。建立Tregs与Foxp3基因或蛋白联系，使Tregs的研究有了进一步的进展[9]。CD8+CD28-Tregs在机体调节机制中有重要作用，可控制自身反应性T细胞，限制机体过度免疫应答或破坏自身组织的作用，使机体免疫平衡稳态得以维持[10-11]。Foxp3在胸腺和外周血CD8+CD28-Tregs中特异性表达，Foxp3基因编码该蛋白，阻止细胞因子分泌[12]。CD8+CD28-Tregs可抑制自身免疫性疾病的发生，参与调节肿瘤免疫。本研究表明，与对照组比较，肝癌患者外周血中CD8+CD28-Foxp3+Tregs的比率明显升高，且此改变与患者的年龄和性别比较差异无关，这与王徐等[13]研究T细胞群和性别无关相一致。本研究的肝癌患者中，Tregs的比率较正常健康对照组明显升高，且Tregs的比率在有淋巴结转移的肝癌患者外周血中明显升高，这与在消化道肿瘤中有淋巴结转移的Tregs显著增高相一致[14-17]。

目前，多数研究对Tregs的检测基于肿瘤患者外周血进行，对肿瘤病理组织同时进行对照研究较少[18-19]。本研究通过石蜡包埋免疫组化法和Western blot的研究发现肝癌患者肿瘤组织中Foxp3阳性细胞数及Foxp3蛋白表达水平显著高于癌旁组织，表明在肝癌患者中，Tregs可能通过某种途径向癌周渗透迁移浸润。Foxp3抑制机体增殖与活化肿瘤特异性T效应细胞，与机体荷瘤时的免疫耐受肿瘤抗原和相关抗原可能有关[20-21]，有文献[22-25]报道Tregs通过趋化因子介导迁移至肿瘤微环境中。本实验中，由于肝癌样本量相对较少，不利于在单项TNM分期和肿瘤分化级别中做Tregs的统计分析，因此基于III/IV期与I/II期、中低分化与高分化肝癌患者Foxp3+Tregs的比率明显增高，提示Foxp3+Tregs可能在肝癌的发生、发展中起着重要作用。

综上，本实验通过对肝癌患者外周血进行检测，采用病理组织学和分子生物学的对照研究，更加直观和准确为临床检测Tregs提供参考。然而，收集远期的完整随访资料，术后检测早期外周血T细胞结果可能受到抗生素使用等多因素的影响，可能会改变淋巴细胞亚群，因此，本研究还需要扩大样本量以获取准确的研究结果。

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