肝纤维化进程中细胞外基质对肝星状细胞的作用及机制研究进展*

秦雨萌综述，陈胜华审校

肝纤维化进程中细胞外基质对肝星状细胞的作用及机制研究进展*

秦雨萌综述，陈胜华审校

肝纤维化是一种肝内弥漫性细胞外基质（ECM）过度沉积的病理过程，且肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生发展的中心环节。本文主要介绍了在肝纤维化进程中ECM各种成分比例、分子结构的改变及其ECM分子空间结构改变对HSC的激活、增殖和凋亡的作用和机制。

肝纤维化；细胞外基质；肝星状细胞

肝纤维化是机体在受到各种有害刺激的作用下导致的损伤-修复反应，是所有慢性肝病共同的病理学变化，其发病基础是细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的合成增多或/和降解减少，导致过多的ECM在肝内过度积聚和沉积[1]。肝纤维化的形成是一个复杂的过程，肝脏内细胞-基质-递质间相互作用，构成了复杂的网络系统，参与了肝纤维化的发生和发展[2]。肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSC）是肝组织中ECM的主要来源，且HSC激活并转化为肌成纤维母细胞（Myofibroblast，MFB）是肝纤维化发生发展的中心环节[3]。近年来，肝纤维化进程中ECM的改变对HSC的作用受到越来越多研究者的关注。肝纤维化进程中ECM的改变包括量的改变（ECM中各种成分比例的改变）和质的改变（分子和空间结构的改变）影响了肝脏内环境，通过一系列的信号传导通路，导致HSC激活、增殖、收缩、迁移和凋亡，进一步加剧了ECM的沉积与紊乱，加速肝纤维化的发展。因此，本文将对肝纤维化进程中ECM的变化对HSC的作用及机制研究作一综述。

1 ECM的主要构成

ECM是由成纤维细胞、间质细胞、上皮细胞等体内各种组织和细胞合成并分泌的一类分布和聚集在细胞表面和细胞间质的大分子物质所构成的复杂网络结构，由I型和IV型胶原，糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）、纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）、层粘连蛋白（Laminin，LN）等构成复杂的空间架构，粘附有大量细胞因子。这种特殊结构不但提供细胞生长的结构支持，同时也对细胞的行为有显著影响，包括促粘附、分化、增殖与功能表达[4]。这种结构一旦发生改变，将对居住其间的细胞的命运产生深远的影响。目前发现至少有28种不同类型的胶原，根据构成ECM框架的胶原成分不同，可将其分为两种：（1）间质性基质；（2）基膜[5]。间质性基质是由胶原等异源物质组成的纤维状超分子结构，存在于细胞与细胞之间。基膜是存在于上皮细胞或内皮细胞以及一些特殊类型细胞（如脂肪细胞、肌纤维）之间的袖套样结构。基膜的组成成分随组织的不同而不同，有的由两层不同的电子密度层组成，分别是紧贴上皮或内皮细胞质膜的低电子密度层以及靠近基质的高电子密度层，也有些组织由三层不同的电子密度层组成，中间为高电子密度层和两侧各为低电子密度层，但大部分成熟的基膜都含有Ⅳ型胶原、LN、珍珠素、着位素、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等[6]。在基膜的结构上含有与细胞膜表面受体特异结合的结合位点，主要是由α和β两个亚基构成的整合素，其中α1β1和α2β1既可以与Ⅳ型胶原结合，也可以与LN结合，α6β1和α7β1只与LN结合，而α5β1只与FN结合[7]。

2 肝纤维化发生过程中ECM的改变

ECM对维持肝脏微环境的稳态有着至关重要的作用。随着肝纤维化的发展，ECM在肝脏中的湿重由0.6%可升高3～6倍、胶原含量由5%～10%可增加至50%左右，正常肝组织蛋白多糖（PG）含量甚微，在肝纤维化时大量增加。肝纤维化时ECM的沉积导致了肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cell,SEC）向血管型内皮细胞转化，SEC窗孔数目减少，导致合成IV型胶原、LN、FN等基底膜成分增多，其中以IV型胶原和LN升高显著，并沉积于狄氏间隙，在内皮下形成连续性基底膜，导致肝脏微循环改变，这些病理改变启动参与肝纤维化的各种细胞因子，HSC被激活分化为MFB，合成并分泌多种ECM成分，如Ⅰ、Ⅲ胶原沉积[8]，并能正反馈调节MFB的增殖[9]。硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，CS）、硫酸皮肤素、透明质酸（Hyaluronic acid，HA）等蛋白多糖（Proteoglycan，PG）也有少许升高，在细胞间和细胞与ECM之间的相互作用起到一定作用。ECM除了其成分含量的增加，分子与整体结构的本质也发生了变化，一部分ECM分子的细微结构发生变化，如GAG的硫酸化程度和胶原β链的羟化程度发生变化等。另外，早期ECM主要沉积在汇管区和窦周间隙（Disse隙）内，引起窦周毛细血管化，出现局部重建或重分布。

3 ECM与HSC

肝纤维化进程中，HSC-ECM-HSC这一个反馈环受到越来越多的重视。在正常情况下，HSC位于Disse间隙内，处于静息状态，当各种致病因素造成肝损伤时，SEC源性FN的水平急剧升高，从而改变了局部ECM的生物学性状，导致ECM沉积，使HSC被激活转化为MFB，具有可收缩性、促炎效应以及促纤维化的特性[10]。HSC通过自分泌或旁分泌的形式，分泌转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β，TGF-β1）、血小板衍生因子（Platelet derived factor，PDGF）、内皮素（Endothelin，ET）等生长因子，进一步刺激HSC的激活和增殖，促进胶原、糖蛋白和PG的合成，从而重构ECM；HSC还能合成基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinasas，MMPs）和金属蛋白酶抑制剂（inhibitor of Matrix metalloproteinasas，TIMPs），TIMPsd的表达量增加抑制MMPs的活性[11]，这种变化使得胶原纤维的降解减少，最终导致ECM沉积。ECM对HSC的作用，主要依赖于细胞与ECM间的直接作用以及细胞因子的作用。在肝纤维化初期，ECM在成份比例和结构框架改变的作用下，通过TGF-β1/Smad[12]、PDGF信号通路等对HSC的激活和增殖产生调节。若不加以干预或治疗，最终会导致肝纤维化向不可逆性发展。

3.1 ECM中各种成分比例的改变胶原纤维的早期变化主要以I、III、IV胶原纤维升高为主，后期I型胶原增加占优势，胶原I/III比值升高，约为正常肝脏的3倍[13]。胶原主要对细胞组织起支持、保护作用，在构成ECM的空间结构上亦有很大作用。有学者研究表明，HSC与I型胶原相连是通过介导精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸序列（RGD）与α2β1整合素的结合[14]，激活FAK-Ras-丝裂素激活蛋白激酶（MAPK）通路，通过PI3K蛋白激酶/PKB信号途径和细胞内钙离子激活PKC家族成员，激活多种转录因子，调控基因表达，从而维持HSC的存活及增殖[15]。

肝纤维化时，FN也有一定程度的升高。FN的功能主要通过表达基质金属蛋白酶-3（Matrix metalloproteinase 3，MMP-3），增加蛋白多糖及基底膜成分的降解。有实验证实，在缺乏FN的情况下，TGF-β及其受体数量增多，通过TGF-β/Smad途径，诱导静止的HSC进一步转化为MFB并合成大量的胶原纤维[16]。其中TGF-β1可上调β-链蛋白的表达并增加其稳定性，通过经典的Wnt信号途径，引起胞内β-连锁蛋白积累，从而下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）的表达，使活化的HSC中表达Ⅰ型胶原的水平升高[17]。同时，枯否氏细胞（Kupffer cell，KC）与FN共培养体系中，能刺激KC产生多种细胞因子，如TNF-α、IL-6等，其中TNF蛋白与TNF-R1胞外区相结合，释放死亡结构域沉默子，通过招募蛋白引起HSC的凋亡与组织损伤[18]，而炎性因子IL-17是通过激活STAT3，由JAK/STAT通路直接诱导HSCs中平滑肌肌动蛋白的表达和胶原的产生[19]。Olsen等[20]发现FN上的结构域-A（EIIIA）无论在细胞培养还是在小鼠肝纤维化模型中，都不能促进HSC转化为MFB，而仅仅是促进HSC的趋化运动。

各种基底膜蛋白，如LN、蛋白聚糖等直接参与整合素联合的细胞信号转导通路，从而使细胞对胞外的信号产生效应[21]。人基膜蛋白属于小富含亮氨酸（SLRP）系列的硫酸角质素蛋白聚糖。在缺乏基膜蛋白的体内实验中，在相同程度的肝损伤情况下，缺乏基膜蛋白实验组更不容易诱导肝纤维化，主要原因可能是肝组织对TGF-β1信号的反应降低，从而HSC活化和胶原的mRNA的生产均受到一定限制[22]。

3.2 ECM中分子的结构变化肝纤维化中还有一些ECM的细微结构变化，如糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）的硫酸化程度改变，硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，CS）分为CS-A，CS-B，CS-C等，主要是根据硫酸化的位置与硫酸化的程度进行分类[23]。有研究发现CS-A能够抑制不饱和脂肪酸的过氧化，显著抑制HSC核转录因子NF-κB的激活，降低MMPs及其mRNA的表达，修复内源性抗氧化剂，减少肝组织损伤，且CS-A的抗氧化能力强于CS-C[24]。CS还可以储存多种细胞因子并形成复合物，如肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）[25]等。其与相应的酪氨酸激酶受体c-met结合抑制HSC增殖，并通过RohA等信号途径诱导细胞凋亡[26]，同时HGF也能通过上调活化HSC表面DR5蛋白表达，促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导HSCs的凋亡[27]。CS硫酸化程度升高会倾向于肝素化，功能减弱并丧失，细胞与细胞、细胞与ECM间的信息传递减少。

参与肝纤维化的胶原主要有早期主要Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原。肝纤维化早期，Disse间隙Ⅳ胶原和LN沉积增加，以其为主的功能性基底膜破坏，在内皮下形成连续性的基底膜和内皮窗孔消失，形成肝窦毛细血管化。HSC被激活，合成大量Ⅰ型胶原，至晚期正常含非纤维形成胶原的低密度基底膜胶原（Ⅳ、Ⅵ型）转化为高密度间质胶原（Ⅰ、Ⅲ型），ECM亚群失调，不溶性Ⅰ型胶原显著增加取代Ⅲ型胶原而成为肝内主要胶原[28]。

3.3 ECM空间结构改变在器官纤维化过程中，ECM的空间再分布及结构改变对细胞的粘附与效应也产生相当重要的影响。有研究者研究肺组织二维弹性网络模型中认为，胶原更可能在已经硬化区域的附近过量沉积，而且胶原沉积在肺纤维化的空间相关性很大程度会导致肺功能下降并且影响细胞再生与重构的环境[29]。同时体外实验研究，壳聚糖-GAG微囊加入混合胶原可使外周的血管内皮细胞进一步长入，并融合形成血管通路，同时微囊内其他细胞密度显著高于普通培养[30]。因而微环境细胞外基质的改变会直接或间接地影响肝脏的整体结构与代谢状况，也决定了肝纤维化是否会由可逆期向不可逆期转变。

ECM在肝组织中的改变主要表现为基质沉积于汇管区及Disse隙，其中也可包括HA、IV型胶原、LN等基膜成分的升高，导致基质孔隙发生改变、窦周毛细血管增生，造成肝窦毛细血管化，形成连续的基底膜。孔隙率变化既可以使细胞通过整合素受体与基质间的联系增强，也增加了细胞与细胞间的联系。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）与HSC之间的接触作用主要通过toll样受体（TLR4），通过接头蛋白MyD88的转导激活NF-κB信号途径，调节HSC核内基因表达的调节，减少胶原的产生[31]，同时也可通过分泌TNF，诱导配体上调死亡受体5和Caspase-3蛋白的表达，从而使肝星状细胞凋亡，从而缓解肝纤维化[32]。有研究证实，血管紧张素原mRNA在肝纤维化进程中先增加在减少，提示血管紧张素也参与组织和肝纤维化的重构过程[33]，通过VEGF促进HSC增殖及Ⅰ型胶原产生，并用布立尼布（VEGFR的选择性抑制剂）在体内能减轻纤维化，在体外能阻断HSC激活[34]。新生的血管无法改善局部的组织缺氧，氧化应激产生的ROS反而加剧了细胞外基质的结构紊乱，通过整合素受体与HSC作用，激活FAK-Ras-MAPK通路从而刺激HSC释放血管生成因子，如血管生成素[35]和PDGF[36]，增强肝窦内皮细胞的活性，进一步促进病理性血管生成过程，二者恶性循环促进肝纤维化[37]。Zhang[38]证实，PPARc可以通过PDGF-β受体，导致HSC趋化减少、血管内皮生长因子表达降低，从而减少HSC驱动的血管生成。

4 小结

研究HSC-ECM-HSC这个反馈环在肝纤维化进程中的作用受到越来越多学者的重视，其重要意义在于启示研究者：如果抑制其中的一个环节或者改变一些影响因素将对整个循环产生效应，这将为临床治疗肝纤维化提供了一个新思路。在肝纤维化进程中，ECM的变化主要包括：成分及比例的改变、结构的改变、空间结构的改变等，通过这3个方面指导了多条途径调节HSC的激活、增殖和凋亡，并提出很多信号转导通路，通过细胞膜受体与配体结合，使胞质区分子结构和功能发生变化，然后转入核内调控基因表达，大致包括：TGF-β/Smad途径、PPAR通路、Wnt信号转导通路、NF-κB信号通路、JAK/STAT通路、PI3K通路和MAPK通路等。ECM中I型胶原纤维的增多，增进了HSC通过介导α2β1整合素的粘附作用并促进增殖，而FN的表达增多通过TGF-β/Smad、PPAR等通路在一定程度上抑制了HSC的活化，相应的炎性因子却大都促进其活化。这些ECM成分的作用已经比较明确，如果通过调节这些蛋白使其抑制HSC的功能占优势，也许可以打破纤维化的趋势。当然还有很多方面需要研究者的深入探讨，比如最新提出的基膜蛋白对肝纤维化进程的抑制作用等，这为研究构成基膜蛋白的一系列蛋白多糖对HSC的作用提供了研究基础；在分子学的角度上，肝纤维化中的ECM存在不同程度的改变，如糖胺聚糖的硫酸化程度变化，结构上的改变引起的效应也值得有更深一步的研究；从整体的角度看，肝纤维化时ECM的支架结构与正常组织大不相同，孔隙率等一系列的改变增加了窦周毛细血管的产生、进一步加速了组织的缺氧坏死。

本文通过综述与总结近年来ECM的相关研究进展，探讨肝纤维化时ECM的改变对HSC激活、增殖、收缩、迁移和凋亡的影响，对防治和逆转肝纤维化过程具有重要意义，ECM在肝纤维化的发生和发展中作用机制非常复杂，并且作用范围相当广泛。因此，进一步深入研究在肝纤维进程中ECM的改变对HSC的影响，能全面的了解肝纤维化的发生和发展的机制，才能为更安全、有效的预防和治疗肝纤维化提供新思路。

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（收稿：2016-11-10）

（本文编辑：朱传龙）

Influence of extracellular matrix on hepatic stellate cells during liver fibrosis process

Qin Yumeng，Chen Shenghua. Deparment of Anatomy，University of South China，Hengyang 421001，Hunan Province

Liver fibrosis is a pathological process characterized by intrahepatic diffuse excess deposition of extracellular matrix（ECM），and hepatic stellate cells（HSC）activation.This article mainly reviewed the changes of various components of ECM，the molecular structure and the spatial structure of the ECM in the process of hepatic fibrosis.And we also summarized the mechanism by which the effects of these changes on the activation，proliferation and apoptosis of HSCs.

Liver fibrosis；Extracellular matrix；Hepatic stellate cell

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.037

南华大学“蒸湘学者”计划资助项目（编号：2016ZXXZ006）；湖南省研究生创新课题（编号：CX2016B476）

421001湖南省衡阳市南华大学医学院解剖学教研室

秦雨萌，女，26岁，硕士研究生。主要从事肝纤维化防治研究

陈胜华，E-mail:chenshenghuaa@163.com