Th22细胞及其细胞因子IL-22在冠心病外周血的表达及与冠脉病变的相关性研究

杨新超 (长江大学第二临床医学院，湖北 荆州 434023)

姜曼 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

胡钢 (长江大学第二临床医学院 荆州市中心医院心血管内科，湖北 荆州 434023)

Th22细胞及其细胞因子IL-22在冠心病外周血的表达及与冠脉病变的相关性研究

杨新超
(长江大学第二临床医学院，湖北 荆州 434023)

姜曼
(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

胡钢
(长江大学第二临床医学院 荆州市中心医院心血管内科，湖北 荆州 434023)

目的：观察冠心病患者外周血Th22细胞及其细胞因子白细胞介素-22(IL-22)的水平变化，探讨其与冠状动脉病变的相关性。 方法：入选冠心病患者60例，其中急性心肌梗死组(AMI)20例、不稳定型心绞痛组(UAP)20例及稳定型心绞痛组(SAP)20例，同时选取同期健康对照组(HC，冠脉造影正常者)20例。采用流式细胞技术检测各组外周血Th22细胞在外周血细胞中的比例；ELISA法检测血浆IL-22浓度；Gensini评分系统评价冠脉病变程度，分析Th22及IL-22与冠脉病变程度的相关性。 结果：AMI组血浆Th22细胞在CD4+T细胞中的比例为(2.02±0.84)%、IL-22浓度为(39.12±5.41)pg/mL，显著高于SAP组(0.74±0.27)%、(28.14±3.78)pg/mL，UAP组(1.20±0.34)%、(33.50±3.47)pg/mL及HC组(0.48±0.19)%、(25.38±3.13)pg/mL，差异具有统计学意义(P均<0.05)；UAP组与SAP组和HC组差异有统计学意义(P均<0.05)；SAP组与HC组差异有统计学意义(P<0.05)。AMI组、UAP组及SAP组患者的Th22细胞比例与IL-22浓度均呈显著正相关，γ分别为0.877，0.764，0.968，P均<0.001。Th22和IL-22与Gensini评分呈显著正相关，person分析，γ分别为0.962，0.889，P均<0.001。结论： Th22细胞及其分泌的主要细胞因子IL-22在冠心病的发生中起重要作用，血浆中Th22和IL-22水平的测定可为早期诊断冠心病及评估冠状动脉病变程度提供临床依据，是一种无创、有效的诊断方法，值得在临床推荐使用。

冠心病；Th22细胞；IL-22；冠状动脉评分

文献报道，自20世纪80年代以来，国外冠心病的发病率和病死率呈逐年下降趋势，而我国冠心病发病率和死亡率居高不下，发病率仅低于印度，位于世界第二[1]。冠心病是多种因素共同作用的结果，以往的多种代表性发病机制学说相互联系、相互补充，但仍未能完整阐释冠心病的发病机制。关于冠心病发病机制的最新研究表明，冠心病的发生与炎症反应密切相关，是一种典型的慢性炎症性疾病，主要以不同的CD4+T淋巴细胞为主，共同介导了冠心病的发生发展全过程[2,3]。Th22细胞是近年来新发现的一种辅助型T细胞亚群，独立于其他已知的T细胞亚群(Th1，Th2，Th17)，主要分泌效应因子IL-22,其与冠心病的研究较少且不成熟，目前关于Th22细胞及IL-22在冠心病患者体内的表达水平，及与Gensini评分的相关性尚无相关报道。本研究观察Th22及IL-22在冠心病患者体内的表达情况，分析其与Gensini评分的相关性，探讨Th22细胞及IL-22与冠心病发病机制的关系，为临床诊断和治疗冠心病提供一种高效、便捷的方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年11月至2016年9月在荆州市中心医院心血管内科住院的冠心病患者60例及同期冠脉造影正常者20例为健康对照组，其中男49例，女31例，年龄54～81岁，平均年龄(65.00±8.12)岁。其中冠心病患者分为三组，分别为稳定型心绞痛组(SAP)20例，不稳定型心绞痛组(UAP)20例，急性心肌梗死组(AMI)20例。20例HC组为CAG正常者，经体格检查血常规、血脂、血糖、肝肾功能均正常，冠脉造影阴性，运动负荷心电图阴性。四组在年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压、体重指数、糖尿病史、血脂异常方面差异无统计学意义(P>0.05)。

排除标准：先心病、肺心病、合并风湿性心脏病及其他严重的心脏瓣膜病、合并各种心肌病、合并肿瘤、心力衰竭、肝肾功能不全、创伤、感染、周围血管病变、自身免疫性疾病，以及3个月内进行心脏外科或介人手术。以上均符合世界卫生组织(WTO)诊断标准。

1.2 方法

所有患者均行心电图、全胸片、超声心电图、肝肾功能等入院常规检查。四组患者抽取静脉血，AMI组的釆血时间于发病后24h之内；UAP组、SAP组及HC组于清晨空腹状态下抽取。所有标本在30min内3000r/min离心10min，分离血清后密封封管，于-80℃保存待测。

1.3 主要试剂

离子霉素、莫能霉素、佛波醇乙酯(PMA)、固定剂、破膜剂、RPMI-1640培养基、PE标记鼠抗人IL-22抗体购自德国美天旎生物技术有限公司，PerCP-Cy5.5标记鼠抗人IL-17抗体、APC标记鼠抗人IFN-γ抗体、FITC标记鼠抗人CD4抗体均购自美国BD pharmingen公司，IL-22ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

1.4 流式细胞技术检测外周血Th22在CD4+T细胞中的百分比

AMI组的釆血时间于发病后24h之内；UAP组、SAP组及HC组于清晨空腹状态下抽取。各组分别抽取静脉血5mL(肝素钠抗凝)，从中取抗凝全血200μL于EP管中，用RPMI1640调整细胞浓度至2.0×106/mL；接种于24孔培养板(1mL/孔)，加入50μl的PMA工作液(1μg/mL)、15μL离子霉素工作液(50μg/mL)、10μl莫能霉素工作液(20μg/mL)混匀，置于5%CO2、37℃细胞培养箱孵育4h；取100μL刺激后血于流式管中，加入4μL FITC标记CD4单抗，室温避光孵育15min后加入100μL 细胞固定液，再室温避光孵育15min；加入3mL 0.9%氯化钠混匀，1500r离心5min，弃掉上清，加入100μL 破膜液，同时加入4μL PerCP-Cy5.5标记鼠抗人IL-17抗体、2μL APC标记鼠抗人IFN-γ抗体、4μL PE标记鼠抗人IL-22抗体，室温避光孵育15min；加入3mL 0.9%氯化钠，1500r离心5min，弃掉上清；400μL 1×PBS重悬细胞，进行流式细胞学上机分析。Th22细胞定义为CD4+IFNγ-IL17-IL22+。

1.5 ELISA检测IL-22水平

将保存的血浆取出，放置于常温下复融备用，IL-22试剂盒检测血浆IL-22的浓度，具体步骤严格按照说明书进行。

1.6 统计学分析

所有数据均采用SPSS17.0统计软件进行分析，组间差异比较采用LSD-t检验，指标间的关系用Pearson相关分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Th22细胞占CD4+T比例及其细胞因子IL-22浓度

AMI组血浆Th22细胞在CD4+T细胞中的比例(2.02±0.84)%、IL-22浓度(39.12±5.41)pg/mL，显著高于UAP组(1.20±0.34)%、(33.50±3.47)pg/mL，SAP组(0.74±0.27)%、(28.14±3.78)pg/mL及HC组(0.48±0.19)%、(25.38±3.13)pg/mL，差异具有统计学意义(P<0.05)；UAP组与SAP组和HC组差异有统计学意义(P<0.05)；SAP组与HC组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 三组冠心病组Th22与IL-22的相关性分析

AMI组患者的Th22细胞比例与IL-22浓度(γ=0.877，P<0.01)呈显著正相关；UAP组患者的Th22细胞比例与IL-22浓度(γ=0.764，P<0.01)呈显著正相关；SAP组患者的Th22细胞比例与IL-22浓度(γ=0.968，P<0.01)呈显著正相关。

表1 各组患者Th22及IL-22水平

注：a:与HC比较，P<0.05；b:与SAP组比较，P<0.05；c:与UAP组比较，P<0.05。

2.3 Th22及IL-22与Gensini评分的相关性分析

Th22和IL-22与Gensini评分呈显著正相关，person分析，γ分别为0.962，0.889，P均<0.001。见图1，图2。

图1 Th22与Genisini评分散点图 图2 IL-22与Genisini评分散点图(正态分布资料，person相关分析γ=0.962，P<0.001) (正态分布资料，person相关分析γ=0.889，P<0.001)

3 讨论

Th22细胞是新近发现的一种T细胞亚群，其在血液CD4+T记忆性T细胞中表型呈CLA+(皮肤细胞淋巴相关抗原)CCR6+CCR4+CCR10+，典型特征为在皮肤炎症性疾病中分泌IL-22和TNF-α，不能分泌IL-4、IL-17或IFN-γ，且与Th17细胞亚群功能相似，故将其命名为Th22细胞亚群[4,5]。文献报道，Th22细胞及其效应因子IL-22在多种炎症反应疾病和自身免疫疾病中表达异常，如类风湿性关节炎、银屑病、慢性异位性皮炎、哮喘、系统性硬化症[6,7]。然而，目前临床上关于Th22细胞及其细胞因子IL-22在冠心病这种慢性炎症性疾病中的确切作用机制尚未完全明确，为探讨及明确Th22细胞及IL-22是否参与冠心病的形成，本研究通过分组比较健康对照组和不同类型冠心病患者外周血中Th22的表达情况及血浆IL-22浓度，并分析不同类型冠心病患者Th22与IL-22的相关性以及探讨Th22细胞和IL-22与冠脉病变程度的相关性。研究结果提示，Th22和IL-22与冠心病的形成密切相关，共同介导了冠心病的发生发展。其共同参与冠心病形成的相关机制可能为：Th22细胞作为一种新型的T细胞亚群，通过分泌IL-22对冠心病的发生发展起重要作用。

Th22分化大量IL-22，当IL-22水平升高达到一定程度时，诱发S100A8、S100A9等促炎分子钙离子结合蛋白表达增多[8]。S100A8/A9作为急性期炎症因子，可以作为急性冠脉综合征(ACS)患者早期检测的特异性指标之一。研究指出，急性冠脉缺血患者，其外周血S100A8/A9水平显著高于稳定型心绞痛患者及冠脉造影正常的健康人[9]。IL-22不仅通过诱导S100A8/A9的产生诱发急性期反应，还可以通过调节纤维蛋白原和血小板参与血液的凝固，当血液中纤维蛋白原和血小板的数量增加时，增加了血管堵塞的风险，诱导ACS的发生[10]。有学者指出，冠脉血管内皮上可能存在IL-22的受体，当IL-22作用于受体时，可能会出现内皮细胞的损伤和凋亡，当损伤没有消除时，血小板粘附聚集，形成血栓，同时稳定性被破坏，斑块形态异常进而破裂出现血栓堵塞血管导致心肌梗死。

IL-22能够上调MMP-1等基质金属蛋白酶增加细胞的活动性[11]。MMP-1可降解基底膜并且加快低密度脂蛋白的氧化和渗入，从而促使单核细胞侵润并转化为泡沫细胞，最终导致斑块的形成，引发斑块破裂堵塞血管。IL-22也能使ICAM表达显著升高，动脉内皮损伤后引起内皮细胞表明粘附性改变，表达粘附分子，使单核细胞粘附于内皮细胞，并迁移进入内皮下层，转化为巨噬细胞，吞噬脂质形成泡沫细胞[12～14]。

本研究还显示，冠心病组内AMI组和UAP组外周血Th22细胞表达水平及血浆IL-22浓度明显高于SAP组，提示Th22及IL-22在人类动脉粥样硬化斑块中的表达水平可能与炎症严重程度和斑块的脆性相关。

Gensini评分全面反映冠状动脉狭窄程度及严重性[15]。本研究通过比较冠心病组Th22及IL-22与Gensini评分的相关性，结果表明Th22及IL-22与Gensini评分均呈显著正相关(γ分别为0.962,0.889，P均<0.001)，提示Th22细胞及IL-22可促进冠状动脉粥样硬化的形成并与冠脉斑块的严重程度成正相关，Gensini评分可以作为间接评价冠脉病变严重程度的一项重要指标。

综上所述，Th22细胞及其效应因子IL-22在冠心病患者外周血中表达异常，冠心病组Th22与IL-22呈显著正相关，且Th22细胞在外周血的表达水平和血浆IL-22浓度与冠状动脉病变程度密切相关。实际工作中，临床医生诊断冠心病患者应重视外周血Th22和IL-22的检测。但本研究选取的样本量较少，分组过程中可能存在不平衡性，且本实验属于回顾性研究，可能存在一些混杂因素，仍未能完全明确Th22细胞及IL-22参与冠心病的发病机制。未来应通过大样本、多中心、前瞻性临床随机对照试验进行验证，明确Th22细胞与IL-22与冠心病的关系，及与冠脉病变程度的相关性。

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[编辑] 刘阳

2016-12-03

杨新超(1991-)，男，硕士生，主要从事冠心病研究工作；通信作者：胡钢，hugang@medmail.com.cn。

R541.4

A

1673-1409(2017)04-0011-04

[引著格式]杨新超，姜曼，胡钢.Th22细胞及其细胞因子IL-22在冠心病外周血的表达及与冠脉病变的相关性研究[J].长江大学学报(自科版)，2017，14(4)：11～14.