TiN涂层生物活性及成骨诱导性研究

Saran Limbu，李瑞延，张彦博，秦彦国

(吉林大学第二医院 关节外科，吉林 长春130041)

TiN涂层生物活性及成骨诱导性研究

Saran Limbu，李瑞延，张彦博，秦彦国*

(吉林大学第二医院 关节外科，吉林 长春130041)

钛合金因其良好的生物相容性而被广泛应用于口腔及骨科临床实践[1-3]。但钛合金往往表现出表面生物惰性，骨传导性差，这一特性导致周围骨组织难以和植入物材料形成骨性结合，最终造成无菌性松动[4]。

通过对钛合金表面进行改性可以改变钛合金本身惰性的这一弊端，促进材料与骨组织直接结合促进骨愈合[5,6]。目前有很多表面改性手段，如酸碱蚀刻、微弧氧化、物理沉积涂层等办法[7,8]。而表面涂层技术在近些年的研究越发受到重视，因其可以保留原有基底材料的物理性能，又能提高其表面性能。

我们发现氮化钛(TiN)是一种很好的涂层材料，TiN具有适宜的硬度，优秀抗腐蚀性能和耐磨性能[9-11]。有趣的是TiN会逐步缓慢氧化，随着O元素的加入，TiN的羟基磷灰石沉积能力得到明显提高。而在模拟体液中的羟基磷灰石的沉积能力一定程度上反应了材料的成骨活性。基于这一前提我们假设TiN具有良好的生物活性和成骨活性，并对其进行研究。我们通过磁控溅射技术在钛合金表面喷涂一层TiN涂层，并通过体外骨髓干细胞培养实验探究生物相容性及成骨诱导活性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

细胞实验相关试剂：基础培养基(低糖DMEM，hygcone)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，胰酶、双抗(青霉素钠、链霉素)和磷酸盐缓冲液(PBS)均购置于美国Gibco公司。扫描电镜(XL-30 ESEM FEG Scanning Electron Microscope， FEI COMPANY)，酶标仪(Varioskan Flash,Thermo scientific)，细胞培养箱。

1.2 材料制备

使用成分为Ti6Al4V的钛片(TC4)作为基底，在其表面进行磁控溅射TiN涂层处理。取胎兔骨髓间充质干细胞进行细胞实验。

1.3 细胞增殖

将钛片置于24孔板中，每孔接种细胞2万个，每两天换液一次，使用CCK-8试剂分别检测1、4、7天的细胞增殖情况。检测时CCK-8试剂与培养液比例为1∶10，37℃避光孵育2 h后在450 nm波长下检测吸光度。

1.4 细胞形貌

钛片放入24孔板中，细胞在钛片上培养4天后，用电镜固定液固定细胞。样本经梯度乙醇脱水，干燥后进行喷金处理，最终在电镜下进行观察拍照。

1.5 细胞活性

制备材料浸提液，当细胞培养至80%融合时加入浸提液培养48 h，含5% DMSO的培养液用作对照，用CCK-8试剂检测吸光度，对材料对细胞活性的影响进行研究。

1.6 成骨能力检测

将钛片置于24孔板中，每孔接种10万个细胞，培养24 h后将培养液换成成骨诱导培养液，每两天换液一次。分别在第14天用茜素红对钙结节进行染色。染色完成在体视显微镜下观察并拍照。

1.7 统计学方法

所有实验数据均独立重复检测 3 次，计量资料比较 采用t检验，多个样本的组间比较采用 ANOVA，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖

如图1所示为骨髓间充质干细胞在TiN和钛合金表面培养1、4、7天的细胞增殖情况。可见TiN涂层在3个时间点细胞都多于钛合金组，尤其是在第4、7天，TiN与钛合金组有统计学差异(P<0.05)。

2.2 细胞黏附

如图2所示,在TiN涂层及TC4均可看到生长黏附的细胞。TiN涂层表面的细胞较伸展，较TC4组有更多的丝状伪足伸展，这表明细胞处于活跃的生长迁移状态[12]。这一结果表明TiN表面更适合骨髓干细胞黏附。

图1 骨髓干细胞在TiN涂层及钛合金表面培养1、4、7天的细胞增殖情况

2.3 细胞活性

如图3所示。TiN和钛合金组细胞数量较多，与含5% DMSO组对比有统计学差异。这表明TiN和钛合金均无细胞毒性，具有较好的生物相容性。

2.4 成骨活性

茜素红染色结果如图4所示，TiN表面及钛合金表面均有红色的钙结节沉积，而TiN钙结节数量面积明显高于钛合金组。这表明TiN能够明显的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

图2 细胞在TiN涂层及钛合金表面的细胞

图3 材料浸提液的细胞毒性检测

3 讨论

生物材料一直是近些年的研究热点，同时具有良好生物相容性和成骨活性的材料对于骨科植入物来说至关重要。本研究成功通过磁控溅技术在钛合金表面制备了TiN涂层。通过细胞增殖实验，在长达7天的细胞培养过程中，TiN涂层组细胞数量一直高于钛合金组，我们发现TiN涂层能明显促进骨髓干细胞的增殖。在细胞黏附试验中，通过电镜观察TiN表面细胞处于良好的状态，伸展出较多的丝状伪足，这表明细胞处于活跃的生长迁移状态。

图4 成骨诱导14天的茜素红染色图片

此外我们进一步进行了材料浸提液的细胞毒性研究，CCK-8检测结果表明，TiN没有细胞毒性。这些研究均表明TiN涂层具有良好的生物相容性，这对于生物材料来说非常重要。在成骨活性研究中，长达14天的成骨诱导结果表明TiN能明显的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。这一结果说明TiN具有良好的成骨活性。

本研究成功通过磁控溅技术在钛合金表面制备了TiN涂层。通过细胞增殖实验、细胞黏附实验、细胞毒性实验和成骨活性研究对生物相容性和成骨活性进行研究，结果表明TiN具有良好的生物相容性和成骨活性。

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吉林省科技发展计划国际科技合作项目(20150414006GH)； 吉林省省级经济结构战略调整引导资金专项项目(2014G072)

1007-4287(2017)03-0479-03

2016-11-19)

*通讯作者