美洲大蠊提取物逆转Bel-7402/5-Fu多药耐药性实验研究
2017-03-30李婷乔婷婷刘俊勇沈琦彭芳
李婷，乔婷婷，刘俊勇，沈琦，彭芳*
（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.上海交通大学药学院，上海200240）
美洲大蠊提取物逆转Bel-7402/5-Fu多药耐药性实验研究
李婷1，乔婷婷1，刘俊勇1，沈琦2，彭芳1*
（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.上海交通大学药学院，上海200240）
目的：探讨美洲大蠊提取物逆转Bel-7402/5-Fu多药耐药性的作用及机制。方法：MTT法检测Bel-7402/5-Fu的多药耐药性及美洲大蠊CⅡ-3和脱脂膏的无毒剂量；Bel-7402/5-Fu细胞线粒体膜电位及Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达情况。结果：Bel-7402/5-Fu对5-Fu表现出较高的耐药性，耐药倍数为66.42。CⅡ-3的使用剂量低于93.37 μg/mL，脱脂膏的使用剂量低于47.81 μg/mL。CⅡ-3和脱脂膏能降低线粒体膜电位，且CⅡ-3较脱脂膏作用强；能抑制Bel-7402/5-Fu细胞Bcl-2蛋白表达，抑制作用随药物剂量增加而加强；促进Bax蛋白表达，促进作用随剂量增加而加强；激活下游通路中Caspase-3，Caspase-9蛋白表达，且与剂量成正相关。结论：美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏能够有效逆转Bel-7402/5-Fu的多药耐药性，其作用机制主要通过降低线粒体膜电位和调控Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达。
美洲大蠊；逆转；肝癌；多药耐药性
多药耐药性（multi-drug resistance，MDR）是指在肿瘤的治疗中，肿瘤复发后对曾经使用过的有效抗肿瘤药物以及未曾用过的作用和作用机制尚不明确的其他抗肿瘤药物作用无效〔1-2〕。
MDR产生机制相对复杂，主要包括以下几种：①高度表达的多药耐药关联蛋白，较多的有P-糖蛋白（P-glycoprotein）、乳腺癌耐药蛋白、肺耐药相关蛋白以及其他多药耐药蛋白；②影响药物代谢；③影响药物作用的靶点；④细胞凋亡受抑制。肿瘤MDR的产生还可能与细胞DNA修复、微管蛋白相关蛋白、蛋白激酶C、体内激素、肿瘤血管形成以及线粒体凋亡等多种因素有关〔3-4〕。
由于MDR的出现，肿瘤治疗作用并无显著提高，即使是一些抗癌效果很好的新药，也通常因为耐药性的存在而失去应有的效果。因此要改善现有肿瘤的化疗方案，提高其有效性，就要对MDR机制进行深入研究，寻求有效的MDR逆转剂是其必然道路〔5-7〕。本研究以人肝癌耐药细胞株Bel-7402/ 5-Fu为研究对象，应用美洲大蠊提取物通过体外逆转其耐药性，观察药物作用效果并探讨逆转MDR的作用机制。
1 材料
1.1细胞株人肝癌细胞株Bel-7402、耐5-氟尿嘧啶人肝癌细胞Bel-7402/5-Fu，均购自上海美轩生物科技有限公司。
1.2药物来源及制备美洲大蠊提取物CⅡ-3（黄褐色冻干粉末）和脱脂膏（褐色黏稠膏状），均由云南省昆虫生物医药研发重点实验室张成桂博士提供。
美洲大蠊脱脂膏的制备：将美洲大蠊全虫干燥后进行粉碎，用70%乙醇冷浸提取3次，将所得乙醇液进行合并、浓缩、提取获得浸膏〔8〕。
美洲大蠊提取物CⅡ-3的制备：将美洲大蠊脱脂膏上聚酰胺柱，依次应用水及不同比例的含水甲醇洗脱，定量收集，分别浓缩。其中某一段的浓缩液经冷冻干燥后即为所用样品〔9〕。
1.3主要试剂及仪器胎牛血清（Solarbio）；RPMI-1640（Gibco）；MTT（噻唑蓝，Solarbio）；DMSO（二甲基亚砜，Solarbio）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天）；线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天）；一抗：Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9，Bax（BD）；二抗：Anti-Mouse IgG（H+ L），Antibody（KPL）。阿霉素（ADM，山西普德）；长春新碱（VCR，齐鲁制药）；维拉帕米（VRP，天津风船）；5-氟尿嘧啶（5-Fu，天津金耀氨基酸有限公司）。
CO2培养箱（BB16UV/BB5060UV）；酶标仪（Thermo scientific）；电泳仪（BIO-RAD）；垂直电泳槽（BIO-RAD）；Transilluminator UV/white 2020D（HFC386STD-V12）；Cold Springs及Kodakl20凝胶成像系统（MVE CRYOSYSTEM 4000）。
2 方法
2.1 Bel-7402和Bel-7402/5-Fu细胞培养Bel-7402细胞接种在含适量RPMI-1640培养基的培养瓶中、37℃、5%CO2培养箱中常规培养，Bel-7402/5-Fu细胞用含25 μg/mL 5-Fu的培养液在相同条件下培养维持耐药性，经传代和收集，取对数生长期细胞进行实验。
2.2 Bel-7402/5-Fu细胞多药耐药性检测取对数生长期的Bel-7402、Bel-7402/5-Fu细胞进行培养，待细胞长成单层后，加入不同浓度的化疗药物（5-Fu：0.2、1.0、5.0、25.0、125.0 μg/mL，ADM：0.2、0.8、3.2、12.8、51.2 μg/mL，VCR：0.25、1.00、4.00、16.00、64.00 μg/mL）。每个浓度设5个复孔，同时设不加药物作为对照组。按MTT法常规处理，自动酶标仪上测各组OD值（570 nm波长）。计算细胞抑制率（Inhibition Rate，IR）和耐药倍数（Resistance Index，RI）。
细胞抑制率IR（%）=［1-（A加药组-A空白组）/（A对照组-A空白组）］×100%
耐药倍数RI=耐药细胞IC50／敏感细胞IC50
2.3美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞毒性检测将Bel-7402/5-Fu对数生长期细胞配成2×105个/mL细胞悬液进行培养，并进行4种不同方式的处理，处理1是Bel-7402/5-Fu+不同浓度CⅡ-3/脱脂膏，处理2是Bel-7402/5-Fu+0.5%DMSO，处理3是Bel-7402/5-Fu+完全培养液，处理4是只加完全培养液。其中CⅡ-3和脱脂膏的终浓度分别为300、100、30、10和3 μg/mL。按MTT法常规处理，于570 nm波长的酶标仪上测光密度值，并计算各组药物对细胞的抑制率，再测算出IC50、IC10。
细胞抑制率IR（%）=［1-（A加药组-A空白组）（/A对照组-A空白组）］×100%
2.4美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞线粒体膜电位的影响实验分组同“2.3项”。不同浓度药物及相应溶剂对照处理细胞48 h后，收集细胞，适量RPMI-1640培养基重悬细胞，加入Rho123染液，令其终浓度为5 μg/mL，37°C避光孵育30 min，离心后PBS洗涤2次，流式细胞仪检测Rh123荧光强度，以荧光强度平均值表示细胞内Rho123浓度。实验重复3次。
2.5美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞Bcl-2、Bax及Caspase-9，Caspase-3蛋白表达的影响实验分组同“2.3项”。不同浓度药物及相应溶剂对照处理细胞48 h后，收集细胞，加入细胞裂解液，置冰上振摇30 min提取蛋白样品。进行蛋白免疫印迹法常规处理，检测Bcl-2、Bax及Caspase-9，Caspase-3的蛋白变化。
2.6统计学分析所有数据采用SPSS 17.0统计软件处理，数据多组间数据比较采用单因素方差分析，结果用表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 Bel-7402和Bel-7402/5-Fu细胞多药耐药性检测Bel-7402对5-Fu、ADM、VCR的IC50分别为（6.96±1.33）、（0.61±0.07）、（13.94±5.06）mg/mL；Bel-7402/5-Fu对5-Fu、ADM、VCR的IC50分别为（482.06±265.11）、（5.54±0.23）、（66.20±11.10）mg/mL。Bel-7402/5-Fu对5-Fu的耐药倍数为66.42>15.00，有高度耐药性；对ADM的耐药倍数为5.00<9.13< 10.00，有中度耐药性；对VCR的耐药倍数为5.06，有低度耐药性。见表1。
表1 Bel-7402/5-Fu与Bel-7402细胞药物敏感性
表1 Bel-7402/5-Fu与Bel-7402细胞药物敏感性
3.2美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞毒性检测应用MTT法检测美洲大蠊提取物CⅡ-3和美洲大蠊脱脂膏的IC50和IC10，由于逆转性实验要排除受试药对细胞的影响，因此我们使用小于IC10的药物剂量进行逆转实验研究。美洲大蠊提取物CⅡ-3对BEL-7402/5-Fu的IC10为（93.37±12.04）μg/mL；美洲大蠊脱脂膏对BEL-7402/5-Fu的IC10为（47.81±10.26）μg/mL。其中美洲大蠊脱脂膏与CⅡ-3比较，发现相同抑制率情况下脱脂膏用量较CⅡ-3用量少，且差异具有统计学意义。最终确定美洲大蠊提取物CⅡ-3的逆转剂量低于93.37 μg/mL，而美洲大蠊脱脂膏的逆转剂量低于47.81 μg/mL。见表2。
表2 CII-3与脱脂膏无毒剂量筛选
表2 CII-3与脱脂膏无毒剂量筛选
注：CⅡ-3与脱脂膏比较**P＜0.01。
3.3美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞线粒体膜电位的影响与耐药空白组对比，CⅡ-3和脱脂膏波峰均左移，荧光强度降低，说明二者对线粒体膜电位降低有一定作用；与阳性组对比，CⅡ-3组波峰与其相当，脱脂膏组波峰右移，说明CⅡ-3较脱脂膏作用强。见图1。
图1 CⅡ-3和脱脂膏对线粒体膜电位的影响
3.4美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞Bcl-2、Bax及Caspase-9，Caspase-3蛋白表达的影响由图2可知亲本细胞Bax表达量高于耐药细胞，Bcl-2表达量低于耐药细胞；与耐药空白组比较，CⅡ-3和脱脂膏可以激活Caspase-3，Caspase-9的表达。应用Western blotting方法检测人肝癌Bel-7402/5-Fu细胞Bcl-2及Bax蛋白表达情况，结果显示，CⅡ-3和脱脂膏能抑制Bel-7402/5-Fu抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达，且抑制作用随CⅡ-3和脱脂膏剂量的增加而加强；能够促进凋亡因子Bax蛋白的表达，促进作用随剂量的增加而增强；能够激活下游通路中Caspase-3，Caspase-9蛋白的表达，且与剂量成正相关。高浓度的脱脂膏较CⅡ-3对Caspase-9蛋白的作用强；低浓度的CⅡ-3较脱脂膏对Caspase-3的作用强。见表3。
图2 CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9蛋白表达的影响
表3 美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞Bax，Bcl-2，Caspase-9，Caspase-3蛋白表达的影响
表3 美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对耐药细胞Bax，Bcl-2，Caspase-9，Caspase-3蛋白表达的影响
注：与空白对照Bel-7402/5-Fu组比较*P<0.05，**P<0.01；与CⅡ-3高剂量组比较#P<0.05；与脱脂膏低剂量组比较※P<0.05。
4 讨论
MDR不仅影响了化疗效果，也是诱导肝癌复发转移的重要原因〔10〕，其作用机制十分复杂，需要多种因素共同参与，通过不同途径来完成，主要有耐药相关蛋白的表达，药物代谢相关酶活性表达和凋亡抑制途径异常等〔11〕。诱导细胞凋亡受抑制是肿瘤细胞发生MDR的主要机制之一，主要包括线粒体途径和死亡受体途径两个主要通路受抑制，其中线粒体依赖性细胞凋亡通路是抗癌药物诱导细胞凋亡的一条重要通路〔12〕。本研究通过美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对肝癌耐药细胞株中多药耐药相关蛋白及凋亡相关蛋白表达的影响，探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对肝癌多药耐药性的逆转作用及可能的作用机制。
本研究以人肝癌细胞株Bel-7402和耐药细胞株Bel-7402/5-Fu为研究对象，通过检测细胞对化疗药物敏感性，可看出Bel-7402/5-Fu细胞对多种化疗药物的抑制率均高于Bel-7402细胞，且对5-Fu显示较强的耐药性，这说明Bel-7402/5-Fu细胞耐药性较好。在细胞毒性剂量筛选实验中，选择非毒性剂量作为逆转剂量，确定美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏的逆转剂量分别为（81.33±12.04）μg/mL、（37.55±10.26）μg/mL，在此最大剂量范围内对细胞无明显毒副作用。
Western blotting检测结果表明敏感细胞中Bax含量高于耐药株，Bcl-2含量低于耐药细胞株，经药物CⅡ-3和脱脂膏诱导后，耐药株中Bax表达增强，且促进作用随药物浓度的增加而增强；耐药株中Bcl-2表达量降低，抑制作用随CⅡ-3和脱脂膏浓度的增加而增强；能够激活下游通路中Caspase-9，Caspase-3蛋白的表达，且呈剂量依赖性关系。药物的作用可以增强促凋亡蛋白Bax的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量，使线粒体膜电位下降，继而激活引导者Caspase-9，进一步活化其下游的Cas⁃pase-3，最终诱导细胞发生凋亡是线粒体途径诱导细胞凋亡的可能机制。
美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏具有一定的多药耐药逆转作用，为拓展美洲大蠊提取物CⅡ-3与脱脂膏联合常规化疗药物应用于临床肝癌耐药性的治疗，提高抗肿瘤药物的化疗效果，为促进临床合理用药提供实验依据和理论支持。另外，耐药机制复杂多变，是多靶点、多因子综合作用的结果，在今后实验中，还应该进一步验证美洲大蠊提取物CⅡ-3与脱脂膏逆转肝癌耐药的作用机制是否与其他机制有关（如P53，微管与微管蛋白，MAPK信号转导通路等），以及在体内实验中进一步验证美洲大蠊提取物CⅡ-3与脱脂膏逆转肝癌耐药的作用，再做临床前药效学评价，为肝癌化疗联合使用美洲大蠊提取物CⅡ-3与脱脂膏克服肝癌多药耐药提供新策略。
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Research of Extracts from Periplaneta americana on Reversing Multi-drug Resistance to Bel-7402/5-Fu
Li Ting1,Qiao Tingting1,Liu Junyong1,Shen Qi2,Peng Fang1*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.School of Pharmacy,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China）
Objective:To investigate the effect and mechanism of extracts fromPeriplaneta americanaon reversing multi-drug resistance to Bel-7402/5-Fu.Methods:Multi-drug resistance to cancer agents and nontoxic dose of thePeriplaneta americanaextract CⅡ-3 and skim cream were evaluated by MTT assay.The effect of mitochondrial membrane potential and expressions of Bcl-2,Bax, Caspase-9 and Caspase-3 were detected in Bel-7402/5-Fu cells affected with CⅡ-3 and skim cream.Results:Bel-7402/5-Fu cells showed high resistance to 5-Fu,the resistance ratio was 66.42.The dose of CⅡ-3 was lower than 93.37 μg/mL,and the dose of skim cream was lower than 47.81 μg/mL.CⅡ-3 and the skimmed cream could decrease mitochondrial membrane potential and CⅡ-3 was stronger than the skimmed cream.CⅡ-3 and the skimmed cream could inhibit the Bcl-2 protein expression of Bel-7402/5-Fu and the inhibition effect increased with the dose amount;could promote the expression of Bax protein and the promoting effect increased with the dose amount;could activate downstream pathways of Caspase-9,Caspase-3,and the promoting effect increased with the dose amount.Conclusion:ThePeriplaneta americanaextract CⅡ-3 and the skimmed cream can effectively reverse MDR in Bel-7402/5-Fu cells.The mechanism is to decrease of mitochondrial membrane potential,and regulate the expression of Bcl-2,Bax,Caspase-9 and Caspase-3 protein.
Periplaneta americana;reversion;Hepatocellular carcinoma;multi-drug resistance
R752.1
A
2096-2266（2017）02-0001-05
10.3969/j.issn.2096-2266.2017.02.001
（责任编辑 李杨）
云南省应用基础研究计划资助项目（2013FA043）
2016-08-09
2016-09-15
李婷，硕士研究生，主要从事抗肿瘤药理学研究. *通信作者：彭芳，教授.
