ADA、TB-Ab在原发不孕症合并潜伏性结核女性月经血中的表达

徐琰琪 吕品 姜丽丽 陈秀娟

潜伏性结核(latent tuberculosis，LTBI)是宿主感染结核杆菌后，由于机体免疫力强，而表现为γ-干扰素释放分析试验(TB-IGRA)阳性或结核菌素试验(Tuberculin skin test, TST)阳性，但无症状或体征，同时又保持潜在的可被激活发病的一种亚临床状态。LTBI中有10%～20%可转为活动性结核[1]。女性生殖器结核(female genital tuberculosis, FGTB)是原发性输卵管性不孕的常见病因之一。被感染者仅有10%发展为活动性结核[2]，一旦妊娠或超促排卵助孕治疗，潜伏性结核有可能激活发病，导致妊娠率低、流产率高，甚至危及生命。研究显示，LTBI者的IVF-ET妊娠率明显低于非结核性不孕症者，且自然流产率较高，规范的抗结核治疗能够明显改善卵巢储备功能和子宫内膜容受性，获卵率也有所提高[2]。因此，生殖器潜伏性结核的早发现、早诊断、早治疗对控制病情发展、提高妊娠率、降低结核传播率及不良后遗症具有重要意义[3]。临床上多数生殖器结核表现不典型、缺乏特异性检查方法，早期确诊率低。而生殖器潜伏性结核的诊断则更困难。鉴于结核分枝杆菌感染宿主时，外周血血清及胸、腹腔积液中ADA及TB-Ab的表达水平会升高[4-6]。本研究旨在检测原发性输卵管性不孕症合并潜伏性结核感染患者的月经血中ADA、TB-Ab表达水平。

对象与方法

一．对象

选取2014年3月—2015年10月就诊于内蒙古医科大学附属医院生殖中心165例因不孕症行辅助生殖技术助孕者为研究对象。将TB-IGRA阳性、主因原发性输卵管因素的女性患者作为LTBI组，共131例,年龄(32.3±4.4)岁；将TB-IGRA阴性、主因原发性男方因素(男方无精子症，极度少、弱精，女方未见异常)助孕治疗的女性患者作为对照组，共34例，年龄(32.4±3.5)岁。所有入组的研究对象均为：年龄小于40岁，无活动性结核临床表现，经影像学检查、子宫内膜组织病理学检查排除活动性结核者。所有患者均充分知情并自愿签署知情同意书。

二、方法

1.收集标本：收集所有入组者月经血，6 h内在无菌条件下采用一次性无菌子宫内膜取样器收集的月经血及子宫内膜。并注意刮取宫角处子宫内膜。收集的月经血立即放入低速离心机中3000 r/min，离心10 min后用移液器取上清1 ml置于无热原、无酶的EP管中，冷冻于﹣80 ℃冰箱中备用。收集的子宫内膜立即转移至无热原、无酶的EP管中，冷冻于﹣80 ℃冰箱中备用。

2.ELISA法检测ADA及TB-Ab：将标本及试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温后，分别将按浓度梯度稀释好的标准品及各个标本液(其中行ADA检测时使用标本原液，检测TB-Ab时用标本稀释液将标本稀释10倍)加入相应的孔中，经孵育、洗板、依次向各反应孔中加入生物素化人ADA/TB-Ab抗体工作液、酶结合物工作液、TMB显色液、终止液等过程后，放入酶标仪中，测定各孔OD值。

3.实时荧光定量PCR法检测结核DNA含量：将子宫内膜标本从﹣80 ℃冰箱中取出，在生物安全柜中研磨。将研磨好的子宫内膜组织转移至无热原、无酶的EP管中，加入50μl的DNA提取液，充分混匀。转移至4 ℃冰箱中静置8 h以保证充分裂解。10 000 rpm离心5 min，取上清液2μl待做PCR反应。分别取出阴性质控品、TB临界阳性质控品、TB强阳性质控品，8 000 rpm离心数秒，吸取50μl至0.5 ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100 ℃恒温处理10 min后，12 000 rpm离心5 min，备用。各个TB阳性定量参考品8 000 rpm离心数秒后备用。探针模式设置：Reporter Dye：FAM, Quencher Dye：TAMRA, Passive Reference：NONE, Date Collection：55 ℃，45 s。设置循环条件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s→10个循环，93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s→30个循环。保存文件后运行。

结 果

一、两组月经血中ADA、CA125、血沉水平的比较

LTBI组ADA、CA125水平显著高于对照组，差异有统计学意义；两组血沉比较，差异无统计学意义；见表1。

表1 两组月经血中ADA水平的比较

注：两组比较，*t=20187，P=0.030；#t=10.269，P<0.001；△t=1.720，P=0.087

二、两组月经血中TB-Ab水平的比较

LTBI组112例行月经血中TB-A检查，水平为(162.91±67.52)U/ml；对照组34例，TB-Ab水平为(106.41±36.08)，两组差异有统计学意义(t=6.357，P<0.01)

三、两组X线胸片检查结果的比较

两组X线胸片显示有陈旧性钙化灶者作为阳性，阳性率比较，差异无统计学意义，见表2。

表2 两组X线胸片检查结果的比较[例(%)]

四、ADA与TB-Ab的相关性

月经血中ADA与TB-Ab呈正相(r=0.274，P=0.001)。

五、LTBI组子宫内膜行实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA结果

LTBI组的子宫内膜行实时荧光定量PCR检测，阳性率为0.76%(1/131)。

讨 论

活动性结核因症状、体征明显，且存在明确的诊断标准，因此，容易被及时发现、诊断及治疗。而潜伏性结核由于病史不典型、症状隐匿、目前缺少特异性检查方法，导致诊断甚为困难[7]。在结核低负担国家(如美国、英国等)，TB-IGRA已被FDA批准用于诊断潜伏性结核感染[7-8]。生殖器结核是不孕的重要原因，尤其在输卵管性原发不孕患者中，生殖道结核的患病率较高。本院统计的原发性输卵管性不孕的腹腔镜检查结果中，结核感染者占13.5%。

腺苷脱氨酶(ADA)在T淋巴细胞的增殖和分化中起到重要的作用[9-10]。因此，当机体的细胞免疫被激活时，如患传染性单核细胞增多症、伤寒、结核病时，T淋巴细胞数目增加，导致ADA表达水平升高。有研究表明，结核患者，包括菌阴肺结核患者血清ADA水平显著高于肺炎、肺癌、正常者的ADA水平[11]。尽管ADA水平在结核病患者体内较正常人高，但ADA不能够作为区分肺结核和其他部位结核感染的合适指标[12]。本实验通过ELISA法直接检测ADA在月经血中的表达水平，结果显示LTBI组ADA水平明显高于对照组。由于月经血直接取自患者宫腔，无外周血的检测，月经血ADA表达水平升高对于生殖道结核感染的临床意义还需进一步研究。

结核抗体(TB-Ab)是机体对感染的结核分枝杆菌发生反应所产生的一种特异性免疫球蛋白，因而具有高度特异性，尤其在菌阴性结核分枝杆菌感染者中的灵敏度较高。本实验在设计时，将外周血TB-IGRA检测结果为阳性的患者作为LTBI组，由于TB-IGRA检测结果不受卡介苗接种或非结核分枝杆菌感染等因素的干扰，因此，TB-IGRA结果阳性，提示体内存在结核分枝杆菌的感染。在此基础上再行TB-Ab水平的检测，可除外检测结果因接种卡介苗而出现假阳性的可能。其次，实验标本直接取自患者的生殖器—子宫腔。通过ELISA法直接检测患者月经血中TB-Ab水平，显示LTBI组TB-Ab水平明显高于对照组。由于无外周血的检测，月经血TB-Ab表达水平升高对于生殖道结核感染的临床意义还需进一步研究。

ADA和TB-Ab在原发性不孕症合并潜伏性感染者体内的表达水平均升高，两者正相关。其原因有可能是，当结核分枝杆菌感染机体时，会激活体内的免疫系统，包括细胞免疫和体液免疫，导致ADA和TB-Ab同时升高。

血清CA125在活动性结核患者体内呈高表达状态，而经抗结核药物治疗后，CA125的水平降至正常范围[13]。本文通过分析对比LTBI组与对照组血清CA125值发现，潜伏性结核感染组者血清CA125表达水平高于非潜伏性结核感染组，两组数值均在正常范围值之内，分析其原因可能与结核处于非活动状态有关。因此，外周血中CA125水平升高提示炎症的存在，对于生殖器的结核性炎症有辅助的诊断意义。

X-线胸片检查是诊断肺结核的常用辅助检查方法。在肺外结核患者的诊断中，仅具有参考意义。

在有临床根据的高度怀疑有结核存在的不孕症女性中行子宫内膜结核分枝杆菌PCR实验，57%的患者呈现阳性，而在无临床根据怀疑结核存在的不孕症者女性中，仅有9.5%的患者呈现阳性[14]。这可能与生殖器结核首要影响的部位是输卵管，其次是子宫内膜，而导致子宫内膜中结核分枝杆菌含量极少有关。本次实验行实时荧光定量PCR检测子宫内膜中结核分枝杆菌的结果显示阳性率极低。分析其有可能存在的原因：(1)高度怀疑潜伏性生殖器结核女性子宫内膜中结核分枝杆菌通常含量较少，且组织标本中结核杆菌不易暴露[15]，而本次实验取材量较少，采样的位置或许并不能代表结核感染的区域，结核感染的区域有可能因结核分枝杆菌的稀疏分布而错过；(2)子宫内膜呈周期性脱落，肉芽肿没有足够的时间形成[16]。因此，对原发不孕症合并潜伏性结核患者查子宫内膜结核杆菌DNA还需要进一步探索。

总之，原发不孕症合并潜伏性结核感染的女性患者月经血中ADA及TB-Ab水平高。原发不孕症合并潜伏性结核感染的女性患者子宫内膜结核分枝杆菌阳性率很低，需要进一步探索潜伏性结核者子宫内膜结核菌DNA的筛查方法。

1 World Health Organization:Global tuberculosis control:epidemiology，strategy，financing:WHO report 2009.Geneva，Switzerland:World Health Organization，2009.

2 Dam P，Shirazee HH，Goswami SK，et al.Role of latent genital tuberculosis in repeated IVF failure in the Indian clinical setting.Gynecol Obstet Invest，2006，61:223-227.

3 Jain K，Jain B.ART outcome in genital tuberculosis in Indian population-a prospective study．ASRM Abstracts，2013，10：1216.

4 尉艳霞，童朝晖，龚娟妮，等.腺苷脱氨酶诊断结核性胸膜炎价值的再评价．中国结核和呼吸杂志，2010，33:273-275.

5 Riquelme A，Calvo M，Salech F，et al.Value of adenosine deaminase(ADA)in ascitic fluid for the diagnosis of tuberculosis peritonitis:a meta-analysis.J Clin Gastroenterol，2006，40:705.

6 何丙生，代秀萍，李双初，等.腺苷脱氨酶、结核抗体及DNA联合检测在结核性积液的临床诊断价值.武汉大学学报，2012,33:544-546.

7 Mazurek GH，Jereb J，Lobue P，et al.A guideline for using the QuantiFERON-TB Gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection，United States.MMWR Recomm Rep，16，54:49-55.

8 Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century:new tools to tackle an old enemy.Chest，2007，131:1898-1906.

9 Farazi A，Moharamkhani A，Sofian M.Validity of serum adenosine deaminase in diagnosis of tuberculosis.Pan Afr Med J，2013，15:133.

10 Russo M，Giancane R，Apice G，et al.Adenosine deaminase and purine nucleoside phosphorylase activities in peripheral lymphocytes from patients with solid tumors.Br J Cancer，1981，43:196-200.

11 Shokrollah Salmanzadeh，Heshmatollah Tavakkol，Khalid Bavieh，et al.Diagnostic value of serum adenosine deaminase (ADA) level for pulmonary tuberculosis.Jundishapur J Microbiol，2015，8:e21760.

12 Bolursaz MR，Khalilzadeh S，Khodayari A，et al.Adenosine deaminase level as an indicator for differentiating between active pulmonary tuberculosis infection and other pulmonary infections.J Compr Ped，2012,3:3-6.

13 Yilmaz A，Ece F，Bayramgürler B，et al.The value of Ca 125 in the evaluation of tuberculosis activity.Respir Med，2001，95:666-669.

14 Thangappah RB，Paramasivan CN，Narayanan S.Evaluating PCR，culture & histopathology in the diagnosis of female genital tuberculosis.Indian J Med Res，2011，134:40-46.

15 高绿芬，罗新.女性盆腔及生殖器结核特征的再认识．中国实用妇科与产科杂志，2008,24：262.

16 Kapoor N，Pawar S，Sirakova TD，et al.Human granuloma in vitro model，for TB dormancy and resuscitation.PLoS One，2013，8:e53657.