苏姜猪A-FABP基因遗传多态性及其与肉质性状的关联分析

朱爱文，倪黎刚，周春宝，朱淑斌，卞桂华

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

苏姜猪A-FABP基因遗传多态性及其与肉质性状的关联分析

朱爱文，倪黎刚，周春宝*，朱淑斌，卞桂华

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

研究采用PCR- RFLP技术分析苏姜猪、姜曲海猪、长白猪群体A-FABP基因遗传多态性，并用统计学方法分析基因座多态与肉质性状的相关性。结果表明：3个猪种A-FABP基因内含子1均具有Bsm I酶切多态性，分别检测到3种基因型（AA、AB和BB），χ2适合性检验显示，3个猪种A-FABP基因型分布处于Hardy-Weinberg平衡（P＞0．05）。多态信息含量（PIC）分析显示，3个品种猪均为中度多态；基因型与肉质性状关联分析显示，不同基因型肌内脂肪含量、大理石纹差异显著，大理石纹AA、AB型显著高于BB型（P＜0．05），肌内脂肪含量AA显著高于AB、BB型（P＜0．05）。结论显示，苏姜猪、姜曲海猪、长白猪A -FABP基因intron 1多态性对肉质性状影响显著。

苏姜猪；A-FABP基因；PCR-RFLP；肉质性状

哺乳动物机体内脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（Adipocyte Fatty Acid-binding Protein，A-FABP）主要在脂肪细胞中参与甘油三酯生成，以增加肌内脂肪（Intramuscular Fat, IMF）含量。研究证实，IMF和肉质呈正相关，影响肉的嫩度、风味和多汁性，肉品2．5%～3%的肌内脂肪含量可获得理想口感[1]。利用分子生物学的手段——分子标记辅助选育（MAS）去寻找控制IMF的基因，并进行品种选育，以期提高肌内脂肪含量，是改善肉质行之有效的方法。

Brockmann等[2]研究发现，A-FABP基因位于含有影响脂肪性状QTL的猪4号染色体上，在脂肪细胞中表达，影响甘油三酯的生成与分解。Gerbens等[3]克隆、测序发现，猪A-FABP基因全长8 144 bp，核苷酸序列包括2 370 bp 的5′-上游区域和1 435 bp的3′-下游区域；含有4个外显子和3个内含子，4个外显子分别编码24、58、34、16个氨基酸，内含子的大小为2 629、840、471 bp，与人、小鼠及大鼠同源性分别为90%、83%、81%。Gerbens等[4]研究表明，杜洛克猪A-FABP多态性与含量IMF存在相关。

本研究以姜曲海猪、苏姜猪（以杜洛克猪、姜曲海猪、枫泾猪为亲本，经7个世代选育，2013年9月经国家畜禽遗传委员会审定为猪新品种）、长白猪为研究对象，采用PCR-RFLP技术对改善猪肉质性状起重要作用的A-FABP基因进行检测、分析，旨在寻找与苏姜猪肉质性状相关的遗传标记，探索改善苏姜猪肉质性状的有效途径，并为苏姜猪种质资源特性及分子标记辅助选择（MAS）研究提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验材料 苏姜猪220头、姜曲海猪96头、长白猪144头，分别来自姜曲海猪保种场、常州康乐农牧公司。取以上猪种耳组织样约0．5 g/头，置于预置70%乙醇的1．5 mL Eppendorf管，-20℃冻存备用。屠宰不同基因型实验猪只，背最长肌中段最后肋与第一、二腰椎间中心部位取样，测定肉质性状指标。

1．1．2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶、DL-2000 Marker、dNTPs、Bsm I限制性内切酶等，分别购自宝生物（大连）工程有限公司、上海生工生物技术有限公司、赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取 参照《分子克隆实验指南》用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl（pH 8．0），1 mmol/L EDTA（pH 8．0）]，4℃保存[5]。0．8%琼脂糖凝胶电泳法检测抽提基因组DNA质量。

1．2．2 引物设计和 PCR扩增体系 PCR引物根据GenBank发布的猪A-FABP基因DNA序列（登录号：Y16039），参考朱弘焱等[6]发表的引物设计，由上海生工生物技术有限公司合成。所设计引物扩增片段大小为783 bp。引物序列见表1。

基因型频率=基因型个体数/测定群体总数。χ2适合性检验法分析基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡状态。基因纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量采用PopGene 32统计软件分析。基因型与肉质性状关联性采用 SPSS（16．0版本）的GLM进行最小二乘方差分析，比较不同基因型之间肉质性状差异，统计模型：

其中，Yijklm为IMF测量值，μ为群体平均值，Ai为场效应，Bj品种效应，Ck为年龄效应，Dl为性别效应，Rm

为基因型效应，eijkl为随机残差效应。

2 结果与分析

2．1 PCR扩增 所设引物用于 PCR 扩增，结果获得了特异性很好的产物（图1），用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度与预期大小一致为783 bp，无非特异性扩增条带，可直接用于RFLP分析。

表1 PCR扩增的引物序列

PCR扩增反应总体系为20 μL：100 ng/μL DNA模板1．0 μL；10×PCR缓冲液2．0 μL；10 μmol/L引物1．0 μL； dNTPs终浓度为200 μmol/L；TaqDNA聚合酶1．0 U；其余用高压灭菌ddH2O补齐。所设计引物的 PCR扩增条件：95℃ 预变性10 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s ，共32个循环，72℃后延伸10 min ，4℃ 保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1．2．3 RFLP分析 用BsmI酶切扩增产物。酶切体系20 μL：PCR扩增产物15 μL，10×Buffer 1 μL，限制性内切酶1 μL，灭菌蒸馏水3 μL，37℃ 反应6～8 h。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像系统拍照分析。

1．2．4 肉质性状测定 测定主要指标包括肉色、大理石纹、pH、失水率、剪切力和IMF含量等。用索氏抽提法提取IMF。测定方法参照相关文献[7-8]。

1．2．5 统计分析 基因频率计算公式：

其中，p是等位基因A的基因频率，q是等位基因B的基因频率，nAA、nAB、nBB分别是群体中基因型AA、AB和BB型的个体数。

图1 猪A-FABP基因PCR 扩增结果

2．2 RFLP 检测 对扩增的PCR产物进行BsmIRFLP分析，结果发现，引物扩增的目的片段存在多态性，出现3种基因型（图2）。

图2 猪A-FABP基因PCR 扩增产物BsmI-RFLP 分析

2．3 不同猪品种A-FABP基因遗传多态性分析

2．3．1 等位基因频率和基因型频率 对3个猪种

A-FABP基因PCR产物进行基因型检测，计算3个猪品种的等位基因频率和基因型频率。表2中χ2适合性检验结果显示，A-FABP基因PCR产物在3个猪种中基因型分布处于Hardy-Weinberg平衡（P＞0．05）。

2．3．2 群体遗传杂合度、纯合度、有效等位基因数及多态信息含量分析 PIC用于对标记基因多态性的估计，是表示DNA变异程度高低的指标。PIC＜0．25为低度多态，0．25＜PIC＜0．50为中度多态，PIC ＞0．50为高度多态。He是衡量群体内遗传变异的有效指标。He越大，群体内遗传变异程度越大。由表3可知，3个猪种均表现为中度多态；苏姜猪遗传多样性比姜曲海猪高。

3 讨 论

3．1 猪A-FABP基因多态性 于小燕等[9]研究发现，松辽黑猪群体存在A-FABP基因5′UTR区域位点多态性，测得3种基因型；李祯等[10]利用微卫星技术研究分析11个猪种A-FABP基因的遗传变异，结果发现微卫星基因座位点高度多态；姜延志等[11]利用PCR-RFLP标记技术检测中国地方猪种雅南猪、大河猪、大河乌猪，研究发现A-FABP基因内含子 1区域BsmI酶切位点具有多态性，发现2个等位基因，3种基因型；张保军等[12]在8个猪种的A-FABP基因内含子1的微卫星位点上，发现16个等位基因，9种基因型。郭瑞等[13]研究猪A-FABP基因的多态性及其与背膘厚的关系，发现民猪、长白猪等群体T65A位点的基因型和基因频率分布存在显著差异，突变位点对背膘厚存在显著的影响，背膘厚度AA型猪显著低于AB型。朱淑斌等[14]研究发现，地方猪种姜曲海猪在BsmI-RFLP位点上存在多态性。本研究在苏姜猪、姜曲海猪、长白猪3个猪种均发现BsmI-RFLP多态性，测得2个等位基因，3种基因型，与姜延志等[11]、朱淑斌等[14]结果相同。

表2 A-FABP基因在 3个猪品种中的等位基因频率和基因型频率

表3 A-FABP基因多态位点纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量

2．4 不同猪种A-FABP基因酶切不同基因型对肉质性状的影响 由表4可知，苏姜猪、姜曲海猪和长白猪A-FABP基因内含子1BsmI酶切后，3种基因型对大理石纹和IMF含量均有显著影响（P＜0．05），大理石纹为AA型和AB型均显著高于BB型（P＜0．05），AA型和AB型之间差异不显著（P＞0．05）；IMF含量为AA型显著高于AB型和BB型（P＜0．05)），AB型和BB型差异不显著（P＞0．05）；其他肉质性状的不同基因型之间差异均不显著（P＞0．05）。

表4 A-FABP基因不同酶切基因型肉质性状比较

3．2A-FABP基因与猪肉质性状的关系 许多学者对猪A-FABP基因与肉质性状的关联进行了分析研究。Andersson等[15]认为在野猪与大白猪杂交F2代群体中第4号染色体上存在影响脂肪沉积的QTL，与Walling等[16]对梅山猪与大白猪杂交F2代群体研究结论相似。姜延志等[9]研究发现，地方猪种大河猪、雅南猪等猪种A-FABP基因内含子1区域存在BsmI位点多态性，IMF含量AA基因型个体极显著高于AB、BB型。Gerbens等[4]在猪A-FABP基因内含子1区内检测到一个（CA）n微卫星序列，杜洛克群体分析发现6种基因型，且AlA3较AlAl基因型IMF含量显著提高。王存芳等[17]研究表明，杜洛克、汉普夏、长白猪、大约克和莱芜猪A-FABP基因微卫星（CA）n位点与IMF含量密切相关。于小燕等[7]在松辽黑猪群体中发现A-FABP基因内含子1位点多态性，不同基因型对大理石纹、IMF含量有极显著影响，而对其他肉质性状影响不显著。本研究中，3 个猪种不同A-FABP基因型在大理石纹和IMF含量2个肉质性状指标中存在显著差异，最小二乘均值关系为AA ＞ AB＞ BB，试验结果与姜延志等[11]、于小燕等[9]相似。

3．3A-FABP基因内含子1区域BsmI位点AA基因型遗传力 经过对7窝89头仔猪的实验室检测，并结合实验猪场生产数据资料，发现苏姜猪A-FABP基因内含子1区域BsmI多态位点AA基因型公猪和AA基因型母猪交配，后代仔猪均为AA型，暂未出现分离或突变现象，该结果可能与检测样品数量偏少有关，是否会出现分离或变异需进一步检测、研究。

4 结 论

本研究结果表明，苏姜猪、姜曲海猪、长白猪3个猪种A-FABP基因内含子1区域存在BsmI位点多态性，检测到2个等位基因，3种基因型（AA、AB、BB），A为优势等位基因。不同基因型与肉质性状关联分析发现，不同基因型大理石纹和IMF含量差异显著，大理石纹最小二乘均值关系为AA、AB型显著高于BB型，IMF含量最小二乘均值关系为AA型显著高于AB、BB型，其他肉质性状的不同基因型差异均不显著。笔者认为，该突变位点值得引起关注，最终定论还需要扩大样本数、增加猪品种数、对标记与肉质性能关联作进一步深入的研究。

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Genetic Polymorphism of A-FABP Gene and Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Sujiang Swine

ZHU Ai-wen, NⅠ Li-gang, ZHOU Chun-bao*, ZHU Shu-bin, BⅠAN Gui-hua
(Jiangsu Agri-animal Husbandry vocation College, Jiangsu Taizhou 225300, China)

Aesearch by PCR-RFLP technical analyzed Sujiang swine, Jingquhai swine and landrace groups’A-FABPgenetic polymorphisms, and analyzed the correlation between loci polymorphism and meat quality traits. Results showed that the three swine-breeds’ A - FABP gene intron 1 haveBsmⅠenzyme polymorphisms, three genotypes were detected (AA, AB, and BB). The Chi-square test results showed that three swine-breeds’A-FABPgenotype distribution in Hardy-Weinberg equilibrium (P＞0.05) .Polymorphism information content (PⅠC), which were moderately polymorphic in three varieties of swines.According to the association analysis of different genotypes of marbling and intramuscular fat content(ⅠMF), signif i cant dif f erence was found in marbling, genotype AA, AB was signif i cantly higher than BB (P＜0.05), intramuscular fat content genotype AA was signif i cantly higher than AB, BB (P＜0.05). Conclusion showed that Sujiang swine, Jiangquhai swine and landrace groups’A-FABPgene intron 1 polymorphism had signif i cant ef f ects on meat quality traits.

Sujiang swine;A-FABPgene; PCR-RFLP; Meat quality traits

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-029

2016-07-25；

2016-08-08

江苏省科技项目（BY2014124）；江苏省农业三新工程项目（SXGC[2014]271）；江苏高校品牌专业建设工程资助项目（PPZY2015A083）

朱爱文（1972-），男，硕士，讲师，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：ZAW_0@163．com

* 通讯作者：周春宝（1973-），男，博士，教授，主要从事动物遗传育种研究，E-mial：zhou_tz@ 163．com