人参茎叶皂甙对鸭禽流感疫苗的免疫增强作用和抗氧化功能的影响

杨金保+张琳+李兆华+李禹涛+吴媛媛+刘红岩+吴家强

摘要：为探讨人参茎叶皂甙（GSLS）对鸭流感疫苗的免疫增强作用和抗氧化功能的影响，给鸭群饮水口服GSLS，同时接种禽流感疫苗，通过检测血清抗AIV特异性HI效价、免疫器官指数、淋巴细胞增殖转化指数、细胞因子和肠黏膜SIgA水平，评价GSLS的免疫增强作用；通过测定血清丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量，评价GSLS对机体抗氧化功能的影响。结果表明：在28和35日龄时，饮水口服中剂量GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价显著高于对照组（P<0.05），与1份疫苗组相比，免疫后2、3、4周，饮水口服GSLS能诱导机体对0.75份疫苗抗原产生的HI效价提高，但是差异不显著（P>0.05），1份+GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价显著提高（P<0.05）；饮水口服GSLS能显著增强鸭脾脏和法氏囊指数（P<0.05），显著提高受ConA刺激产生的脾淋巴细胞增殖转化指数，显著或不显著提高脾淋巴细胞上清中IFN-γ（Th1）和IL-4（Th2）水平，显著提高鸭肠黏膜SIgA含量；饮水口服中剂量GSLS组血清MDA和SOD含量分别显著低于和高于对照组（P<0.05）。因此，饮水口服GSLS具有增强鸭群对禽流感疫苗的免疫应答水平和机体抗氧化功能的作用。

关键词：禽流感疫苗；人参茎叶皂甙；肉鸭；免疫增强作用；抗氧化功能

AbstractTo discuss the effects of GSLS on immunopotentiation to AI vaccine and antioxidation of body， the ducks were orally-administrated GSLS and then subcutaneously immunized with AI vaccine. The blood samples were collected to detect the specific hemagglutination inhibition （HI） titers， immune organs index， lymphocyte proliferation and transformation index， cell factor and intestinal mucosa SIgA level， then the immunopotentiation of GSLS was evaluated. The contents of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase（SOD） in serum were detected to evaluate the effects of GSLS on body antioxidation. The results showed that compared with the conventional breeding management， orally-administrated middle-dose GSLS group could significantly increase the serum HI titer of 28-and 35- day-old ducks， significantly decreased the content of MDA， and significantly increased the level of SOD in ducks injected with AI vaccine. Compared with the one dose of vaccine， orally-administrated GSLS could improve the HI titer of 0.75 dose of vaccine without significant difference and significantly improve the HI titer of one dose of vaccine after immunized for 2， 3 and 4 weeks. Compared with the group immunized with AI vaccine alone， orally-administrated GSLS could significantly improve the indexes of spleen and bursa of Fabricius， splenic lymphocyte proliferation and transformation index stimulated by ConA， secretion of SIgA on intestinal， and significantly or not significantly improve the IFN-γ（Th1）and IL-4（Th2） levels in serum of splenic lymphocyte of ducks. Therefore， oral administration of GSLS enhanced the immune responses to AI vaccine and antioxidation of ducks.

KeywordsAvian influenza vaccine； Ginseng stem and leaf saponin； Meat duck； Immunopotentiation； Antioxidation

鴨流感（aivan influenza，AI）是由AIV引起的一种病毒性人畜共患传染病，家禽、水禽及一些野生鸟类均易感染，能造成巨大经济损失。鸭在AIV流行过程中容易成为流感病毒贮库，存在向其它易感动物、人类等散播病毒的潜在危害，容易引发重大公共安全问题[1]。目前，对鸭流感的防控除采用严格的生物安全措施外，主要措施是给易感鸭群接种禽流感疫苗。虽然已经在养鸭业中广泛采取接种商业化禽流感疫苗的措施，但是畜禽临床调查发现，存在鸭群禽流感抗体水平参差不一，抗体水平不高，甚至在养殖业中仍常见有鸭群禽流感免疫失败的现象发生[2]。因此，研究提高鸭禽流感疫苗免疫效果对于提高鸭流感的防控技术水平具有重要意义。

皂甙是由甙元与糖相连构成的糖甙类化合物，是中药人参的有效成分之一，研究发现其对神经系统、心血管系统和免疫系统产生广泛的药理作用[3]，是人参发挥补气安神的药理作用基础之一。人参皂甙广泛来源于人参的根、茎、叶、花等部位[4]，人参茎叶皂甙（GSLS）就是从人参的茎和叶中提取的总皂甙。与根皂甙相比，GSLS来源于中药人参收获的废弃部分——茎和叶，在畜牧业中推广具有比较明显的成本优势。而且，研究发现GSLS具有类似于根皂甙的多种皂甙单体，有些单体含量甚至高于根皂甙中的含量[5]。目前，已经有GSLS调节小鼠、鸡等动物免疫功能的研究报道，但尚未见在肉鸭上的研究报道。因此，有必要开展GSLS调节肉鸭免疫功能的研究，为提高鸭流感防控技术水平和养殖效益提供重要的理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

GSLS（吉林省宏久生物科技股份有限公司），ConA和LPS（美国Sigma公司提供），AI灭活疫苗（哈尔滨维科生物技术开发公司），SIgA、MDA（malondialdehyde， 丙二醛）、SOD（superoxide dismutase， 超氧化物歧化酶）、IL-4和IFN-γ等ELISA试剂盒（北京华英生物技术研究所）。

1.2试验动物

1日龄樱桃谷鸭，购自潍坊某肉鸭养殖场。

1.3仪器设备

二氧化碳培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；酶标仪（美国热电公司）。

1.4试验方法

试验一：将1日龄肉鸭分成4组，每组50只，分别设对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组。对照组给予正常的饲养管理，高、中、低剂量组分别在5～14日龄时饮水口服12、6、3 mg/kg bodyweight（BW）的GSLS。在14日龄时给肉鸭接种1份AI灭活疫苗。分别在1、7、14、21、28、35和42日龄时对肉鸭进行称重和采血，离心分离血清，检测血清抗AIV特异性HI效价，并测定28日龄各组抗氧化指标（MDA和SOD）变化。每次试验操作按照先称重，再采血，然后饮水给药，最后接种疫苗的顺序进行。HI效价测定采用血凝抑制（HI）试验，参照《高致病性禽流感诊断技术 GBT 18936—2003》操作步骤进行。MDA和SOD参照北京华英生物技术研究所试剂盒说明书进行操作。

试验二：将1日龄健康肉鸭分成5组，每组50只。分别设1份疫苗组、1份+GSLS组、0.75份+GSLS组、0.5份+GSLS组、0.25份+GSLS组。1份疫苗组，在14日龄时接种1份AI灭活疫苗；1份+GSLS组，在14日龄时接种1份AI灭活疫苗，并在5～14日龄期间饮水口服由试验一确定的剂量即6 mg/kg BW的GSLS；0.75份+GSLS组，在14日龄时接种0.75份AI灭活疫苗，并在5～14日龄期间饮水口服6 mg/kg BW的GSLS；0.5份+GSLS组，在14日龄时接种0.5份AI灭活疫苗，并在5～14日龄期间饮水口服6 mg/kg BW的GSLS；0.25份+GSLS组，在14日龄时接种0.25份AI灭活疫苗，并在5～14日龄期间饮水口服6 mg/kg BW的GSLS。各组分别在免疫后0、1、2、3和4周龄时对肉鸭进行称重和采血，离心分离血清，检测血清抗AIV特异性HI效价。每次试验操作按照先称重，再采血，然后饮水给药，最后接种疫苗的顺序进行。在免疫后1、2和3周龄时，对1份组和1份+GSLS组肉鸭，每组取8只，颈部放血处死，无菌操作摘取脾脏、胸腺和法氏囊，进行称重，测定免疫器官指数（免疫后2周）；制备脾淋巴细胞悬液，测定淋巴细胞增殖转化水平（免疫后2周）和脾淋巴细胞上清中细胞因子（IL-4和IFN-γ）分泌水平（免疫后2周和3周）；收集空肠，刮取肠黏膜，进行肠道SIgA浓度测定（免疫后1周和2周）。免疫器官指数和淋巴细胞增殖转化指数测定参照相关文献操作进行[6， 7]。SIgA、IL-4和IFN-γ参照北京华英生物技术研究所试剂盒说明书进行操作。

1.5数据处理

試验结果以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 19.0统计软件进行LSD统计分析，以P<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1不同浓度GSLS对鸭血清HI效价的影响

不同浓度GSLS对鸭血清抗AIV特异性HI效价的影响结果见图1，可以看出，在28、35日龄时，与对照组相比，口服中剂量GSLS能显著提高鸭血清抗AIV特异性HI效价（P<0.05），在其它日龄时，组间血清抗AIV特异性HI效价差异不显著（P>0.05）。

2.2口服GSLS对不同剂量疫苗免疫鸭血清HI效价的影响

口服GSLS对不同剂量疫苗免疫鸭血清抗AIV特异性HI效价的影响结果见图2，可以看出，在免疫后2、3和4周时，与1份疫苗组相比，1份+GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价显著升高（P<0.05）；0.75份+GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价高于1份疫苗组，但是差异不显著（P>0.05）；0.5份+GSLS组与0.25份+GSLS组血清抗AIV特异性HI效价显著下降（P<0.05）。

组间不同字母表示差异显著（P<0.05），下同。

2.3口服GSLS对鸭脾脏淋巴细胞增殖转化的影响

口服GSLS对鸭脾脏淋巴细胞增殖转化的影响结果见图3，可以看出，1份+GSLS组鸭脾脏淋巴细胞体外受ConA刺激产生的淋巴细胞增殖能力显著高于对照组（P<0.05），而受LPS刺激产生的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异不显著（P>0.05）。

2.4口服GSLS对鸭细胞免疫功能的影响

口服GSLS对鸭细胞免疫功能的影响结果见表1，可以看出， 1份+GSLS组鸭脾淋巴细胞体外受ConA刺激后血清IFN-γ含量，在免疫后2周和3周，均显著高于1份免疫组（P<0.05）；1份+GSLS组鸭脾淋巴细胞体外受ConA刺激后血清IL-4浓度，在免疫后2周，与1份免疫组差异不显著（P>0.05），在免疫后3周，显著高于1份免疫组（P<0.05）。

2.5口服GSLS對鸭免疫器官指数变化的影响

口服GSLS对鸭免疫器官指数的影响结果见表2，可以看出，1份+GSLS组鸭脾脏指数和法氏囊指数显著高于1份疫苗组（P<0.05），而胸腺指数与1份疫苗组差异不显著（P>0.05）。

2.6口服GSLS对肠黏膜SIgA含量变化的影响

口服GSLS对肠黏膜SIgA含量变化的影响结果见图4，可以看出，在免疫后1周，饮水口服GSLS组鸭肠黏膜SIgA含量与对照组比较差异不显著（P>0.05）；在免疫后2周，饮水口服GSLS组鸭肠黏膜SIgA含量显著高于对照组（P<0.05）。

2.7口服GSLS对鸭抗氧化功能的影响

口服GSLS对鸭抗氧化功能的影响结果见表3，可以看出，饮水口服中剂量GSLS组鸭血清MDA浓度（MDA含量）显著降低（P<0.05），SOD浓度（SOD活力）显著升高（P<0.05）。

3讨论与结论

体液免疫应答是由机体B细胞产生的以抗体为主要效应分子的免疫应答[8]，血清抗AIV特异性HI效价高低直接反映鸭抵抗流感病毒感染能力的高低。在家禽养殖业中，广泛采用给易感动物接种AI疫苗刺激机体产生特异性抗病毒抗体来防控AI发生。本研究结果表明，饮水口服中剂量GSLS能显著提高鸭血清抗AIV特异性HI效价，说明饮水口服GSLS能提高机体体液免疫应答，增强鸭群抗AIV感染能力，表现出良好的口服免疫增强作用。AI是一种人畜共患传染性疾病，对鸭等易感动物采用抗体合格率来判定AI疫苗免疫合格的主要评判指标[9]，而临床调研发现，抗体合格率不高已成为导致AI频发的重要因素之一。而本研究发现的口服GSLS能提高鸭群血清抗AIV特异性HI效价恰好证实其能提高抗体合格率，说明GSLS能作为一种免疫佐剂有效提高鸭群抗AIV感染能力。

在兽用疫苗生产中，抗原剂量是影响疫苗免疫效果和关系疫苗生产成本的重要因素。低剂量抗原的疫苗不能诱导机体产生有效的免疫应答，血清特异性抗体效价低、抗体合格率低，仍然会造成传染病的频发；反之，高剂量抗原的疫苗会导致疫苗生产成本大幅增加，间接导致养殖成本增加，降低养殖利润[10]。免疫佐剂能增强机体对疫苗抗原的免疫应答，具有降低疫苗抗原用量的效果，成为评价疫苗免疫佐剂的一个重要指标[11]。本研究结果表明，0.75份+GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价与1份疫苗原组鸭血清抗AIV特异性HI效价相比，统计学显示差异不显著。疫苗抗原剂量减少0.25份，GSLS仍能刺激鸭群产生与1份疫苗抗原诱导机体产生相同水平的血清抗AIV特异性HI效价，说明饮水口服GSLS具有一定降低疫苗抗原用量的作用。

淋巴细胞增殖指数是反映机体细胞免疫应答水平的指标之一[12]。一般来说，淋巴细胞增殖转化能力高，机体的特异性细胞免疫应答能力则强。本研究结果表明，口服GSLS能显著提高鸭脾脏淋巴细胞受ConA刺激后的淋巴细胞增殖转化指数，说明口服GSLS能提高鸭群的细胞免疫应答水平，从而增强机体抵御病毒感染能力。细胞因子是免疫细胞受抗原或丝裂原刺激后产生具有清除机体病原体、调节免疫应答过程等作用的效应分子，是机体细胞免疫应答的主要效应分子，也是动物机体抗病毒感染中的重要辅助因素之一[13]，因此细胞因子分泌水平的高低反映机体细胞免疫应答能力的强弱。本研究结果表明，饮水口服GSLS能显著提高鸭脾脏淋巴细胞受ConA刺激后上清IFN-γ（Th1）和IL-4（Th2）水平（P<0.05），说明饮水口服GSLS能增强机体的Th1和Th2型细胞免疫应答。而Th1和Th2型细胞免疫在抗病毒感染和调节体液免疫应答中均发挥一定作用[8]，本研究结果证实GSLS是一种比较理想的免疫佐剂。

胸腺、脾脏和法氏囊是家禽的重要免疫器官，参与机体全身的体液免疫应答和细胞免疫应答，是动物免疫系统执行免疫功能的重要组织结构，其发育状况直接决定家禽机体免疫应答水平的强弱，免疫器官重量成为评价动物机体免疫应答水平的指标之一[7]。免疫器官指数是免疫器官重量与其体重的比值，是衡量免疫器官发育状况方法之一，成为表征机体免疫应答水平高低的指标之一。一般来说，免疫器官指数越大，说明机体的免疫应答水平越强。本研究结果表明，饮水口服GSLS显著提高鸭群的脾脏和法氏囊指数（P<0.05），说明GSLS具有增强机体免疫功能的作用，与本研究发现的饮水口服GSLS能提高鸭血清抗AIV特异性HI效价和细胞免疫应答水平结果相一致，说明GSLS是一种有效的口服免疫佐剂。

动物机体的呼吸道、消化道和泌尿生殖道的黏膜中分布有丰富的免疫细胞，这些免疫细胞组成了机体黏膜免疫系统[14]。机体的黏膜免疫系统是病原微生物突破机体防御的主要屏障，也是机体免疫应答的重要组成部分，机体的体液免疫、细胞免疫应答都有黏膜免疫系统的参与。因此，黏膜免疫功能成为评价免疫佐剂的主要指标之一。SIgA是肠道黏膜免疫的主要效应分子，成为评价肠道黏膜免疫功能的指标。从本研究结果可以看出，饮水口服GSLS后鸭群肠道SIgA含量显著高于对照组（P<0.05），说明GSLS具有增强机体肠道黏膜免疫功能的作用，表现出一定的黏膜免疫佐剂潜质。有研究发现，黏膜免疫能激活机体黏膜免疫和系统免疫应答[15]。而本研究发现饮水口服GSLS组鸭群的体液免疫应答水平升高，该结果恰好说明饮水口服GSLS通过增强机体黏膜免疫功能来激活机体体液免疫应答，可能是GSLS发挥口服免疫佐剂作用的机制之一。此外，GSLS发挥免疫佐剂效应还可能与GSLS中皂甙单体的构效关系[16]、皂甙对免疫细胞的刺激作用[6]有一定关系。

在正常状态下，动物机体内氧化与抗氧化过程保持动态平衡，当机体遭受病原微生物等外源性或内源性有害刺激时，氧自由基产生速度远超抗氧化系统的清除能力，过量氧自由基破坏正常组织和细胞功能，导致机体处于氧化应激状态，从而诱发动物出现多种疾病或加重疾病发展[17]。MDA是细胞膜多不饱和脂肪酸过氧化物的降解产物，能反映机体脂质过氧化程度高低，成为表征机体过氧化损伤的指标之一。SOD是机体内一种自由基防御酶，能清除機体内的过氧化物，能反映机体抗氧化程度高低，成为表征机体抗氧化能力高低的指标之一[18]。本研究结果表明，饮水口服GSLS能显著降低血清MDA水平，显著提高血清SOD水平，说明GSLS能够调节鸭群体内氧化与抗氧化动态平衡，维持鸭群肠道氧化还原状态，保持生物膜完整性[19]，与相关资料报道的人参具有抗氧化功能相一致[20]。有研究发现，脂质过氧化能损伤机体免疫功能[21]。本研究结果说明，GSLS可能通过提高机体的抗氧化功能来增强机体免疫功能，可能是GSLS发挥免疫佐剂作用的机制之一。

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