红茶菌A4发酵功能饮料的研制

孙玉坤，李亚霖，赵亮，籍保平，周峰

(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，植物源功能食品北京市重点实验室，北京，100083)

红茶菌A4发酵功能饮料的研制

孙玉坤，李亚霖，赵亮，籍保平，周峰*

(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，植物源功能食品北京市重点实验室，北京，100083)

以红茶茶汤(质量分数0.5%)、蜂蜜(质量浓度6.54%)作为发酵底物，接种本课题组前期分离纯化，并拥有知识产权的红茶菌葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobactersp., A4)10%进行发酵，而研发出一款新的功能性饮料。这株菌代谢产出具有保肝护肝功效的功能因子D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL)。静置于30 ℃环境下4～5 d得到发酵液，再将发酵液经离心、抽滤、调配、罐装、密封、杀菌等一系列工序，制成有功能性和独特风味的、可以进行工业生产的饮料。经过感官评价确定最终饮料配方为：87.35%发酵原液，12.24%白砂糖，0.16%柠檬酸，0.25%苹果酸。最终通过抗氧化能力的测定，与市售红茶菌发酵饮料进行比较，评定本产品的抗氧化性最佳。

红茶菌；发酵；功能饮料；抗氧化

红茶菌发酵饮料大多以家庭自制为主，市面上鲜有成功产品，其菌株均为混合菌株，由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌等多种菌种共同组成，将原料经过生物技术发酵工艺后，代谢产生营养物质，具有一定的保健功能[4]，并赋予产品酸甜相宜、清香爽口的风味[1]。红茶菌是历史悠久的酸性保健饮料，其起源可以追溯到我国古代秦朝时期，但目前红茶菌的研究多在菌种分离鉴定、代谢产物鉴定以及红茶菌抑菌特性上，对红茶菌应用的研究较少[2]，而本实验恰为红茶菌研发出新型的饮料。本实验选用的菌种是从红茶菌混合菌株中分离出来的一种单一菌株——葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobactersp., A4)，该菌株经过代谢途径特异性高产功能因子D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(D-saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL)。DSL的保肝护肝功能已被证实，MICHAEL等人在1996年便提出红茶菌的解毒抗癌作用可能是因为红茶菌液中存在DSL[4]，在KIM等人的研究中提出，0.03～0.15 mg/mL的DSL具有显著的解毒、抗癌作用[3]，特别是预防和治疗癌症方面，对癌症早期具有良好效果[19]。因此，红茶菌A4菌株发酵饮料的研发和其投入工业化生产具有广阔的前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯蜂蜜，蕊悦同仁堂市售；云南滇红红茶，北京吴裕泰茶叶股份有限公司专卖店售；葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobactersp., A4)，保藏于中科院微生物菌株保藏中心(专利号：ZL 2004 1 0091488.X)；食品级碳酸钙，河南思远生物科技有限公司；食品级酵母抽提物，唐山拓普生物科技有限公司；食品级柠檬酸、食品级DL-苹果酸，北京易秀博谷生物科技有限公司；白砂糖，北京闽松经贸有限公司；甲醇(高效气相色谱用)(Methanol)，西陇化工股份有限公司；D-葡萄糖二酸1,4-内酯(D-saccharic acid 1,4-lactone monohydrate)，美国Sigma公司。

对比样品：样品A：自主研发产品，红茶菌A4菌种发酵，常温存放至少6个月以上；样品B：红茶菌混合菌株发酵饮料，市售，货架期较长，为12个月，常温保存；样品C：红茶菌混合菌株发酵饮料，市售，货架期较短，为15 d，需0～7 ℃冷藏；样品D：红茶菌混合菌株发酵饮料，市售，声称内含野生沙棘。

1.2 仪器与设备

全自动杀菌釜MLS-3020，日本三洋电器有限公司；双人单面净化工作台SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司；生化培养箱LRH-250，上海一恒科技有限公司；水浴振荡器HZS-H，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；高速台式离心机TDL-5-A，北京市长风仪器仪表公司；Softmax Pr，MD酶标仪SMP500-15275-SWXN， MD, Enterprise；糖度计LB80，广州市铭睿电子科技有限公司；气相色谱仪GC-2010，日本岛津公司；一次性使用无菌注射器1ML 20140408，江苏治宇医疗器材有限公司；微孔滤膜(有机/尼龙66)0.22 μm，津隆。

1.3 方法

1.3.1 菌种的驯化与发酵条件

种子液的制备：先配制液体培养基，4 g葡萄糖(100 g/L)，0.4 g酵母浸出物(10 g/L)，0.8 g CaCO3(20 g/L)，纯净水40 mL，全部使用食品级试剂，pH调制6.8[5]。灭菌后晾凉，在超净工作台中用接种环从斜面接3～4环至液体培养基中。置于30 ℃水浴振荡器中振荡培养24 h，待接种至第1次扩大培养液，接种量为20%。

第1次与第2次扩大培养：先进行培养液的配制，3.0 g红茶(每升基液应称取5 g)，用煮沸的纯净水浸泡3次，每次15 min，最后将3次茶汤混合，共600 mL(第1次扩大培养液用80 mL，第2次扩大培养液用320 mL)制成0.5%红茶茶汤。再加入蜂蜜并溶解，蜂蜜固形物含量为76.4% Bx，加入量为65.4 g/L(根据红茶菌糖利用率最高的情况确定)，故称取39.27 g。灭菌备用。第1次与第2次扩大培养各置于30℃水浴振荡器中振荡培养24 h，从第1次扩大培养液接种至第2次扩大培养液中的接种量也为20%。

发酵条件：发酵基液的配制与第1、2次扩大培养液相同，称取15.0 g红茶，用煮沸的纯净水浸泡3次，每次15 min，最后将3次茶汤混合，共3 L红茶茶汤，加入196.34 g蜂蜜并溶解，从中取2.7 L发酵基液灭菌备用。从第2次扩大培养液中接种至基液，接种量为10%，静置于30 ℃恒温环境中发酵8 d，并隔天取样(第0、2、4、6、8天)。样品于-80 ℃下保存待测。

1.3.2 灭菌条件

使用高压灭菌釜，121 ℃，15 min。

1.3.3 DSL的测定气相色谱条件

标准品配制：准确称取DSL 100.000 0 mg，并用甲醇定容至10 mL容量瓶中，得到浓度为10 000 g/L。从上述溶液中取5、2、1、0.5、0.1 mL，各自定容至10 mL容量瓶中，得到浓度分别为5 g/L、2 g/L、1 g/L、0.5 g/L、0.1 g/L的标准品。

样品前处理：取第4天、第8天样品的1号、2号、3号于离心管中3 000 g、15 min离心，取上清液1 mL至干燥小烧杯中，在鼓风干燥箱中以85 ℃烘干，再分别用4 mL甲醇溶解，封口膜密封。将溶液倒入7 mL离心管中3 000 g、15 min离心，再用一次性无菌注射器将上清液吸出于4 mL离心管中，使之通过0.22 μm的滤膜。标记好后放置在-20 ℃下保存待测。

色谱柱：J&W DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.250 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度50 ℃保持1 min，以12 ℃/min升至220 ℃，保持8 min；载气(N2)流速1.2 mL/min，压力2.4 kPa，进样量1.0 μL；分流比：1∶10。

1.3.4 总糖的测定

蒽酮比色法。

1.3.5 总酸的测定

电位滴定法。

1.3.6 感官评价

选择消费者型感官鉴评人员，做嗜好性感官评价分析，选取的鉴评人员需要自愿进行试饮，身体健康，具有一定语言表达能力，对试样持客观态度[7]。研发者先对正交的实验样品进行试饮，选出5款最有可能被大众所接受的配方，再对这5款饮料进行感官评价。盛装器皿无特殊标记，编号随机且无含义，分发评价标准和评价表，以产品的气味、色泽、风味、形态作为评分依据，以具有独特的产品风味、色泽均一、无杂质、澄澈透明、风味酸甜适宜为评分标准，权重比例算得最高分者作为产品的最终配方。

表1 红茶菌A4发酵保肝功能性饮料感官评价评分细则

1.3.7 抗氧化活性测定

1.3.7.1 DPPH自由基清除率测定

参照丁艳如等[18]的方法，稍作修改。加入样品2 mL、0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL于5 mL带盖离心管中，混匀，用锡纸包裹，反应30 min，在517 nm下用酶标仪测定吸光度值。

DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：Ai为加入DPPH和2 mL甲醇测得的吸光度值；Am为加入DPPH和样品测得的吸光度值；An为加入样品和2 mL甲醇测得的吸光度值。

1.3.7.2 超氧阴离子(·O2-)清除率测定

参照丁艳如等[18]的方法，稍作修改。加入0.05 mol/L(pH 8.2)的Tris-HCl缓冲液4.5 mL于10 mL带盖离心管中，25 ℃下保温10 min，加入样品1 mL、6 mmol/L的邻苯三酚0.4 mL，混匀，静置反应4 min后，加入8 mol/L的HCl溶液1 mL终止显色反应，在320 nm下用酶标仪测定吸光度值。

·O2-清除率计算公式为：

式中：Ad为蒸馏水代替样品时测得的吸光度值；Ap为样品测得的吸光度值；Aq为蒸馏水代替邻苯三酚时测得的吸光度值。

1.3.7.3 羟基自由基(OH·)清除率测定

参照丁艳如等[18]的方法，稍作修改。加入样品1mL、9mmol/LFeSO4溶液1mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液于带盖离心管中，最后加入8.8mmol/LH2O2溶液1mL启动整个体系，在37 ℃下反应30min，在512nm下用酶标仪测定吸光度值。

OH·清除率计算公式为：

式中：Ak为蒸馏水代替样品测得的吸光度值；Ax为样品测得的吸光度值；Ay为蒸馏水代替H2O2时测得的吸光度值。

1.4 工艺优化试验说明

成品需经过图1的主要工艺流程制得。首先获得A4菌种，进行菌种驯化，配制种子液和两次扩大培养液，每阶段均在30 ℃水浴中振荡培养24 h，各阶段间接种量为20%，随后以10%的接种量接种至基液中。基液中红茶质量浓度为0.5%、蜂蜜为6.54%，接种后于30 ℃环境下静置培养4～5 d得到发酵液，再将发酵液经离心、抽滤、调配、罐装、密封等一系列工序，制成有功能性和独特风味的、可进行工业生产的饮料。经过感官评价确定最终饮料配方为：87.35%发酵原液，12.24%白砂糖，0.16%柠檬酸，0.25%苹果酸。

结果显示DSL的浓度是随发酵时间而逐渐增加的，即发酵后第8天的功能因子浓度比第4天大，而出于感官因素舍弃了第8天的样品。第8天的样品已呈现出发酵的腐败气味，口感酸味过重，蜂蜜风味较淡，而第4～5天样品既有清新的风味，又有酸甜适宜的口感，且未出现不正常味道。

图1 主要工艺流程Fig.1 The main process flowchart

2 结果与分析

2.1 总糖含量

发酵过程中，红茶菌A4菌株对葡萄糖的消耗与培养时间呈线性相关(R2≥0.9)[8]，并且红茶菌的发酵主要在前4天完成，多酚含量、糖度、pH都会明显下降，菌体大量繁殖，耗糖量大，酸度增高[8]。8天发酵过程中总糖含量的变化呈明显的线性关系(R2≥0.99)。

图2 发酵8天内总糖变化趋势Fig.2 Result of total sugar

红茶菌利用发酵液中的糖类物质，产生各种酸、风味物质以及功能因子DSL，所以总糖随发酵时间的延长而总体呈下降趋势。

2.2 总酸含量

发酵液中的总酸含量随着发酵时间的增加而增加，经品尝，发酵到第4～5天时酸度比较适口，而发酵时间继续延长则会产生一些其他的代谢产物，使得其口味发生不良变化。

图3 发酵8天内总酸变化趋势Fig.3 Result of total acid

微生物发酵分解葡萄糖、果糖等碳水化合物，经过2个代谢途径，产生了各种不同的酸性物质，使得发酵液整体呈酸性。一方面赋予了产品酸味，另一方面提高了产品的保藏性能。

2.3 功能因子DSL含量

能够代谢产生较多功能因子DSL的菌株较少，而A4菌株正是其中之一，A4菌株代谢葡萄糖(主要)的途径是葡萄糖——葡萄糖醛酸——葡萄糖二酸——葡萄糖二酸1,4-内酯，而次要的途径为糖酵解途径(Embden-Meyerhof-Parnaspathway，EMP)，生成丙酮酸，再氧化生成乙酸[9]。

表2 气相色谱标准品数据

表3 发酵8 d内功能因子DSL及感官变化

通过气相色谱法对样品中的DSL进行分离测定，根据峰面积及标准品曲线，确定不同发酵天数的样品中所含有的DSL浓度，综合其口味及DSL含量，最终确定第4天为发酵终点也是发酵的最佳时间。

2.4 配方分析与感官评价

对发酵终止后的产品进行可溶性固形物、总酸的测定，测得第4～5天时发酵液的可溶性固形物含量为5%，总酸含量为2.953 8 g/L，糖酸比约为5∶3。

为使产品口感酸甜可口，添加白砂糖作为甜味剂，柠檬酸和苹果酸作为酸味剂进行复配，以增强口感丰富度，强化风味。由于柠檬酸(阈值为0.1%～1.0%)的酸感强烈，但是持久性差；而苹果酸的口感较为柔和，回味持久，故两者复配后可得到较为适中的口味，比例为2∶3较为适宜[12-13]。

经过10位接受感官评价的评分者对不同配方饮料的品尝及打分，按权重比例算得最高分的组别为第4组配方，评分结果如下。

表4 五种不同配方的添加剂添加量与感官评价结果

表5 红茶菌A4发酵功能性饮料配料表

2.5 抗氧化活性评价

将自主研制的红茶菌A4发酵饮料与其他3种市售红茶菌发酵饮料进行了抗氧化活性方面的功能比较。

样品A：自主研发产品，红茶菌A4菌种发酵，实验时已在常温存放至少6个月，滋气味与外观均未发生改变，颜色最深，深褐色。

样品B：红茶菌混合菌株发酵饮料，市售，货架期较长，为12个月，常温保存，310 mL塑料瓶包装，不透明，入口后酸味刺激，回味甜，颜色居中，褐色，实验时已有5个月货架期，形态仍比较稳定，未见异常；

样品C：红茶菌混合菌株发酵饮料，市售，货架期较短，为15 d，需0～7 ℃冷藏，300 mL玻璃瓶包装，存放6 d左右后瓶内出现菌膜，略有异味，味道加酸，颜色最浅，浅褐色，饮料中含气，形态不稳定。

样品D：红茶菌混合菌株发酵饮料，市售，声称内含野生沙棘，1 000 mL玻璃瓶包装，瓶内含有黄色悬浮物，会挂在液面处的玻璃瓶内壁，颜色居中，褐色。

2.5.1 DPPH清除能力

从图4中可以看出，4种红茶菌发酵饮料均对DPPH自由基具有较强的清除能力，各样品的清除率均在90%以上。其中自主研发的DPPH自由基清除率虽未名列第一，但是经过Tukey数据分析，各个样品间差异并不显著，说明从各个样品的DPPH 自由基清除率并不能比较出哪种产品抗氧化性更好。

图4 DPPH自由基清除能力测定Fig.4 The measurement of Scavenging activity on DPPH free radical

Tukey'smultiplecomparisonstestMean1Mean2MeanDiff.95%CIofdiff.SignificantSummaryAvs.B0.92260.9397-0.01713-0.1258to0.09155NonsAvs.C0.92260.9355-0.01290-0.1216to0.09579NonsAvs.D0.92260.9863-0.06373-0.1724to0.04496NonsBvs.C0.93970.93550.004236-0.1044to0.1129NonsBvs.D0.93970.9863-0.04660-0.1553to0.06209NonsCvs.D0.93550.9863-0.05083-0.1595to0.05785Nons

2.5.2 超氧阴离子清除能力

图5 超氧阴离子清除能力测定Fig.5 The measurement of scavenging activity on ·O2-

Tukey多因素检测Mean1Mean2MeanDiff.95%CIofdiff.Significant?SummaryAvs.B0.72340.47250.25080.2064to0.2953Yes****Avs.C0.72340.67840.044990.0005412to0.08943Yes*Avs.D0.72340.58860.13480.09033to0.1792Yes****Bvs.C0.47250.6784-0.2058-0.2503to-0.1614Yes****Bvs.D0.47250.5886-0.1160-0.1605to-0.07160Yes***Cvs.D0.67840.58860.089790.04535to0.1342Yes***

2.5.3 羟基自由基清除能力

从图中6可看出，样品A的OH·清除率最高，可达95%以上，高于其他3个样品；其中样品B的OH·清除能力最弱，低于50%。根据Tukey数据分析，样品A与样品B间存在显著性差异，与样品C及样品D间差异不显著。说明，自主研发的产品的OH·清除能力优于样品B但与样品C和样品D无可比性。

图6 羟基自由基清除能力测定Fig.6 The measurement of Scavenging activity on OH·

Tukey'smultiplecomparisonstestMean1Mean2MeanDiff.95%CIofdiff.Significant?SummaryAvs.B0.96640.43240.53400.3761to0.6919Yes****Avs.C0.96640.85720.1092-0.04872to0.2671NonsAvs.D0.96640.91140.05502-0.1029to0.2129NonsBvs.C0.43240.8572-0.4248-0.5827to-0.2669Yes***Bvs.D0.43240.9114-0.4790-0.6369to-0.3211Yes****Cvs.D0.85720.9114-0.05417-0.2121to0.1037Nons

3 结论

以红茶茶汤(质量分数0.5%)、蜂蜜(质量分数6.54%)作为发酵底物，课题组分离的红茶菌葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobactersp., A4)10%进行发酵，静置于30 ℃环境下4～5 d得到发酵原液。发酵液较发酵前溶液总糖减少，总酸增加、pH降低，菌株代谢产出已证实具有功能因子D-葡萄糖二酸1,4-内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone monohydrate, DSL)，并经气相色谱仪定性定量测得浓度为0.390 mg/mL，为有效浓度范围内。发酵原液在经离心、抽滤、调配、罐装、密封、杀菌、感官评价等一系列工序后，用87.35%发酵原液、12.24%白砂糖、0.16%柠檬酸、0.25%苹果酸配制成产品。成品不仅具有原料蜂蜜及红茶风味，还有独特的发酵风味，口感酸甜可口，味道醇厚飘香，还具有一定的保健功效，并可以进行工业生产。

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Development on functional fermented beverage with Kombucha A4

SUN Yu-kun, LI Ya-lin, ZHAO Liang, JI Bao-ping, ZHOU Feng*

(Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources, College of Food Science & Nutritional Engineering,China Agricultural University, Beijing, 100083, China)

In this study, 0.5% (mass concentration) black tea and 6.54% (mass concentration) honey (with soluble solids content of 76.4%) were used as substrate to fermentGluconacetobactersp., A4, a strain of Kombucha separated and purified in our laboratory earlier, at inoculum concentration of 10% to develop a new kind of functional beverage. Kombucha could produce functional factor with liver-protecting effect named D-Saccharic acid 1,4 lactone monohydrate (DSL). The beverage with unique flavor and taste was obtained after fermentation at 86 ℉ for about 4-5 days. The fermented liquid was centrifuged, filtrated, mixed, filled into bottle, sealed, and sterilized to obtain industrial product. After sensory evaluation, the final formula of the beverage was determined as follows: 87.35% fermented liquid, 12.24% sugar, 0.16% citric acid and 0.25% malic acid. Finally, compared with three commercially available Kombucha beverages, our product has the highest resistance tooxidation.

kombucha; fermentation; functional beverage; oxidation resistance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702025

本科(周峰副教授为通讯作者，E-mail：zf@cau.edu.cn)。

2016-08-08，改回日期：2016-10-19