十堰市苯丙酮尿症儿童苯丙氨酸羟化酶基因突变检测研究

易燕 刘芳 柴艳婷 纪宏先 李珍

·调查研究·

十堰市苯丙酮尿症儿童苯丙氨酸羟化酶基因突变检测研究

易燕 刘芳 柴艳婷 纪宏先 李珍

目的 分析十堰市苯丙酮尿症(PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的突变特点，以指导产前诊断。方法 纳入2012年1月至2015年12月十堰市确诊的PKU患儿15例为研究对象，应用PCR产物直接测序法，检测患儿PAH基因全部外显子及其启动子区域序列。结果 30个PAH等位基因中，突变基因出现19个，占63.3%，类型共10种。突变类型主要为R243Q、R241C、Y365X、R111X，其余均为散在发生突变，对比国内外文献及PAH相关国际数据库，未见新的基因突变类型。结论 十堰市PAH基因突变具有多样性和复杂性，R243Q、R241C、Y365X、R111X为其主要突变位点。

苯丙酮尿症；儿科；苯丙氨酸羟化酶；基因突变

苯丙酮尿症(PKU)为常染色体隐性遗传病，由苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变，导致PAH活性降低或丧失，使苯丙氨酸在体内大量积蓄所致[1]，该疾病可影响神经系统发育，导致严重的智力低下及神经行为异常[2,3]。早期诊断、及时治疗是降低疾病影响的重要措施[4,5]，因此明确患儿PKU基因的突变特点，提升基因诊断效果有重要意义。该疾病的发病有显著的种族及地域差异[6]，本研究重点探讨了十堰市患儿PAH基因突变特点，旨在提升该疾病的早期诊断、遗传咨询和孕前干预效果，报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 纳入对象共15例，均为2012年1月至2015年12月十堰市新生儿疾病筛查中心筛查确诊或门诊就诊后确诊的经典型PKU患儿，患儿监护人均对本研究知情同意。患儿年龄20 d～5岁,平均(2.2±0.7)岁，户口在我市且至研究结束时未变动，初诊时血清苯丙氨酸浓度274～2 710 μmol/L、平均(1 857.6±582.4)μmol/L，患儿均经尿喋吟分析排除四氢生物喋吟缺乏症。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器:全血基因组DNA提取试剂盒、2×RCR Master Mix、DNA纯化试剂盒，均购自北京天根生物技术有限公司；Chelex-100，购自Biorad；引物合成，由上海生工生物技术有限公司提供；PCR扩增仪、基因测序仪，购自ABI。

1.2.2 DNA提取:采用全血基因组DNA提取试剂盒进行：①将经EDTA抗凝处理的200 μl全血置入1.5 ml 离心管，加入20 μl蛋白酶K，混匀后加入200 μl 缓冲液GB，颠倒混匀并放置10 min，使溶液变清凉，随后加入200 μl无水乙醇，颠倒混匀；②所得混合液置入吸附柱CB3，以12 000 r/min速度离心30 s，弃废液，吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD，同条件离心30 s，弃废液；③吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW，同条件离心30 s，弃废液，重复1次；④吸附柱CB3再次同条件离心2 min，弃废液后室温放置，晾干残留漂洗液；⑤吸附柱CB3转入新的离心管，向吸附膜中间加入50～200 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2～5 min，以12 000 r/min速度离心2 min，将溶液收集到离心管中。

1.2.3 引物设计:应用Primer5设计13对引物，分别用于扩增PAH基因1-13外显子及侧翼序列，引物区域、序列及扩增片段长度见表1。

1.2.4 PCR扩增及测序:在ABI 9700型扩增仪上进行PCR反应，总反应体积20 μl，包括1.5 U Taq DNA聚合酶，引物浓度2 pmol/L，dNTP 2.5 mmol/L。先设定95℃预热，持续15 min；94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，此加热方案共持续20个循环，且每个循环退火温度下降0.2℃；第20个循环结束后，以94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，此加热方案共持续15个循环；最后72℃延伸，持续5 min。产物接受2%琼脂糖凝胶电泳、后续测序反应。产物直接测序，样品纯化及分析均由中国优生优育基因科学专家指导中心完成。

表1 PAH基因全长外显子扩增引物序列及扩增片段长度

2 结果

2.1 患者PAH基因测序结果 15例纳入患儿中，6例检出2个突变基因位点，包括1例纯合突变，7例检测1个突变基因位点，2例未检测出基因突变位点。见表2。

2.2 PAH基因突变类型及分布频率 在本研究所检测的30个等位基因中，共发现19个突变基因，检出率63.3%。此19个突变基因共包括10种突变类型，其中错义突变5种、无义突变3种、缺失突变1种、剪切位点突变1种。R241C、Y356X突变频率最高，均为13.3%，其次为R243Q，为10.0%，再次为R111X，为6.7%，且为纯合突变，其余均为散在发生。经科技查新、查阅国内外文献、查询PAH专业网站及数据库，证实未见新的PAH基因突变类型。见表3。

3 讨论

PKU是少数可治的遗传代谢性疾病之一[7-9]，早期发现、早期诊断、早期治疗能够有效改善患儿预后，使患儿智能及神经功能发育接近正常人。该疾病形成的分子基础是PAH基因突变，导致的PAH结构及活性变化。报道指出，PAH基因的突变点多位于编码区，只引发一个或多个氨基酸改变，突变对酶活性的影响程度有差异，主要取决于突变的类型和位点[10]。受基因检测技术的发展影响，PKU的诊治效果显著提升，早期检测PAH基因突变能够对早期诊治、遗传咨询及孕前干预均有积极作用，研究证实PAH基因突变存在明显的种族和地域分布差异[11-13]，国内报道的突变种类有100余种，且还在不断上升，但有关十堰市的PAH突变基因却少有研究报道，这不利于本地区PKU的控制，本研究则有助于弥补此方面空白。

表2 患儿PAH基因测序结果

表3 患儿PAH基因突变及构成

本研究报道的15例PKU患儿中，共检测出10种、19个基因突变类型，主要表现为R243Q、R241C、Y365X、R111X突变，提示十堰市开展PKU产前基因诊断或进行相关基因突变研究时，需要重点关注上述突变，这与国内其他报道既有相似性也有差异性。如强荣等[14,15]报道陕西地区PAH基因突变类型中，R243Q为特点突变，但其突变检出率89.10%，高于本研究；朱文斌等[16,17]报道福建地区主要PAH基因突变型也包括R241C，但其他还包括R408C、EX6-96A>G，这与本研究结果不同。本研究患儿致病基因突变广泛存在于PAH基因的第3、7外显子上，而既往报道显示日本人主要集中在第6、7、12外显子，欧洲人更多集中于第3、10、12外显子[18-20]，这表明十堰市PAH基因突变存在高度异质性；对比国内部分研究，可见十堰市PAH基因突变涉及的外显子与宁夏、苏州地区存在一定差异性，表明国内不同地区PKU患儿PAH基因突变分布也存在明显差异。但本研究并未发现与国际国内既往报道不同的新型PKU基因突变类型，这提示十堰市PAH基因突变又与其他地区存在一定相似性。

基因突变检出率的差异除受到检测方案的影响外，可能还提示本地部分患儿突变基因可能出现于PAH基因的13个外显子之外区域；或其致病机制并非PAH基因突变，而可能涉及到基因表达的顺式作用元件、反式作用因子、启动子、增强子等因素。

综上所述，十堰市PKU儿童PAH基因突变存在一定地域特征，具备一定的多样性与复杂性，目前所知的主要突变种类为R243Q、R241C、Y365X、R111X，掌握其特征对PKU的早期诊治、遗传咨询及孕期检查有一定作用。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.02.042

442000 湖北省十堰市妇幼保健院

刘芳，442000 湖北省十堰市妇幼保健院；

E-mail：984489965@qq.com

R 725.893

A

1002-7386(2017)02-0300-03

2016-06-09)