柚皮素对破骨细胞特异性基因及OPG/RANKL/RANK表达的影响

2017-03-28吴新涛石晶高乐才吴文元庞石磊

河北医药 2017年2期

吴新涛石晶高乐才吴文元庞石磊

·论著·

吴新涛石晶高乐才吴文元庞石磊

目的观察柚皮素对破骨细胞特异性基因组织蛋白酶-K(CATK)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及骨保护素/核因子-κB 受体活化因子配体/核因子-κB 受体活化因子(OPG/RANKL/RANK)表达的影响。方法采用全骨髓细胞诱导法培养破骨细胞，细胞分5组：空白对照组、HG-DMEM诱导组、HG-DMEM+0.1 μmol/L柚皮素组、HG-DMEM+1 μmol/L柚皮素组、HG-DMEM+10 μmol/L柚皮素组。HE染色、TRAP染色观察破骨细胞形态；分光光度计检测TRAP阳性细胞数；Real time-PCR和Western-blot检测CATK、MMP-9、TRAP及OPG/RANKL/RANK mRNA和蛋白表达。结果与空白对照组比较，HG-DMEM诱导组TRAP阳性细胞数、TRAP、MMP-9、CATK、RANKL、RANK mRNA和蛋白表达明显增加，OPG mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)。与HG-DMEM诱导组比较，柚皮素预处理24h能够明显降低TRAP阳性细胞数、CATK、MMP-9、TRAP、RANKL、RANKmRNA和蛋白表达，增加OPGmRNA和蛋白表达(P<0.05)，呈剂量依赖性。结论柚皮素能够抑制破骨细胞的生成和分化，该作用可能是通过OPG/RANKL/RANK信号通路抑制TRAP、MMP-9、CATK表达实现的。

柚皮素；破骨细胞；OPG/RANKL/RANK信号通路

近年来，骨质疏松症发病率逐渐升高，已经成为影响人们生活质量的主要疾病之一[1]。其病理机制是成骨细胞介导的骨生成和破骨细胞介导的骨吸收过程失衡，导致骨吸收速率超过骨生成，最终引起骨量丢失。破骨细胞是唯一具有骨吸收作用的细胞，其来源于骨髓造血干细胞，在RANKL、M-CSF诱导下形成，对于维持骨量至关重要[2]。中草药柚皮苷属黄酮类物质，具有抗氧化、保护神经、治疗骨质疏松症等药理作用。柚皮素是柚皮苷的主要代谢产物，体外实验表明柚皮素对大鼠成骨细胞促骨形成活性优于柚皮苷[3,4]。然而，柚皮素是否影响破骨细胞的分化、成熟目前尚不清楚。本研究利用体外培养的破骨细胞，通过观察柚皮素对破骨细胞特异性基因CATK、MMP-9、TRAP及OPG/RANKL/RANK表达的影响，旨在阐明柚皮素防治骨质疏松症的具体分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料高糖-DMEM(HG-DMEM)培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；兔抗鼠CATK、MMP-9、TRAP、OPG、RANKL、RANK、β-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；细胞裂解液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；Prime Script TM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒购自日本Takara公司；Trizol、实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司。抗TRAP检测试剂盒购自南京建成生物研究所。

1.2 动物雌性SD大鼠，胸自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物合格证号：SCXK-(京)2012-0001]体重180～215 g，清洁级，恒温、恒湿条件下饲养。

1.3 仪器 Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统(Biorad公司)；7300 型Real time-PCR扩增仪(美国ABI公司)；倒置显微镜(日本 Olympus 公司)。

1.4 破骨细胞诱导培养参照相关文献报道采用全骨髓细胞诱导培养法培养破骨细胞[5]。大鼠无水乙醚处死后，75%乙醇浸泡10 min，无菌手术切取双侧股骨，去除表面附着的肌肉和筋膜，75%乙醇浸泡1 min，于超净工作台上剪掉两端干骺端，充分暴露骨髓腔，PBS反复冲洗。骨髓细胞1 000 r/min离心5 min，弃上清，接种于培养瓶中，加入HG-DMEM培养基(含10%FBS，青、链霉素各100 U/ml)，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养30 min。收集细胞悬液，接种于6孔板中，加入含40 ng/ml RANKL和40 ng/ml M-CSF的HG-DMEM培养基液诱导培养7 d，调整细胞密度为1×107/ml，每3天换液1次。待细胞生长至80%融合时根据需要进行相关指标的检测。

1.5 分组及给药细胞分5组：空白对照组(只加HG-DMEM培养基)；HG-DMEM诱导组(加入含RANKL、M-CSF各40 ng/ml的HG-DMEM诱导液)；HG-DMEM+柚皮素组，在HG-DMEM诱导液存在的情况下，分别加入0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L柚皮素。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 HE染色观察破骨细胞形态:细胞消化后接种于24孔板中，调整细胞密度为1×107/ml，进行HE染色，在(×200)显微镜下观察细胞形态。

1.6.2 破骨细胞计数:细胞接种于24孔板中，进行TRAP染色，镜下可见胞浆中红色颗粒样沉淀，即为TRAP阳性染色，细胞核呈阴性，计数有3个及3个以上细胞核的细胞为破骨细胞。每孔随机选取3个视野(×200)，计算均值。

1.6.3 分光光度计检测TRAP活性:收集细胞上清液，于530 nm波长处检测吸光度值，严格按照试剂盒说明书计算TRAP活性。

1.6.4 Real time-PCR:Trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以β-actin为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2ΔΔCt。见表1。

表1 Real time-PCR引物序列

1.6.5 Western-blot:提取细胞总蛋白，半干法电泳转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h。依次加入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，化学发光法显色、定影。用UVP软件扫描测定蛋白条带IOD值，β-actin作为内参照，以目的蛋白与β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 大鼠破骨细胞的培养和鉴定HE染色结果显示，最初采集的骨髓造血干细胞呈大小一致的圆形，悬浮生长。3d后可见单核细胞数目逐渐增多，细胞突起互相连接，细胞逐渐融合；培养5d时单核细胞融合汇聚现象更明显，逐渐形成多核的破骨细胞； 7d时多核的破骨细胞数量达峰值，细胞形态不规则，胞体较大，胞核约3～20个，细胞边缘不整，周边可有伪足伸出。破骨细胞TRAP染色可见镜下具有大量空泡和伪足的多核细胞，胞浆呈紫红色阳性反应，细胞呈圆形，数量不等，胞体呈煎蛋状、漏斗状、索条状，形态不规则。

2.2 柚皮素对破骨细胞形成数量、TRAP活性的影响与空白对照组比较，HG-DMEM诱导组破骨细胞数量、TRAP活性明显增加，给予不同剂量柚皮素能够明显降低破骨细胞数量、TRAP活性，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表2。

组别TRAP阳性细胞数TRAP活性(U/L)空白对照组67.23±6.142.78±0.35HG-DMEM诱导组206.35±13.67*10.14±1.56*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素组166.21±10.64*#8.42±1.12*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素组132.53±10.42*△6.20±0.88*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素组91.56±7.44*☆4.01±0.57*☆