瑞士乳杆菌LH-G51冻干菌粉生产工艺研究

雷 丹，韩 迪，蒋德意，甘 聃

(润盈生物(上海)有限公司，上海 201700)

瑞士乳杆菌LH-G51冻干菌粉生产工艺研究

雷 丹，韩 迪，蒋德意，甘 聃

(润盈生物(上海)有限公司，上海 201700)

目的：对瑞士乳杆菌LH-G51菌粉生产工艺进行优化。方法：通过单因素及正交试验设计，确定适合LH-G51生长的发酵培养基、冻干保护剂配方及生产工艺。结果：发酵时间、碳氮源及微量元素添加量均对LH-G51生长有明显影响。最终确定LH-G51培养基碳氮源及微量元素为葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、酵母膏15 g/L、MgSO4·7H2O为250 mg/L、MnSO4·H2O为50 mg/L、发酵时间10 h、保护剂为B。结论：根据优化工艺，LH-G51冻干菌粉活菌数可达到4.21×1011CFU/g。

瑞士乳杆菌；生产工艺；保护剂；冻干菌粉

瑞士乳杆菌是人体肠道内的一种益生菌，也是干酪制品中常用的乳酸菌发酵剂[1]，因其能产生多种活性肽以及胞外蛋白酶能优先水解α-CN 和β-CN，故其发酵乳有降血压、抑制肿瘤、降胆固醇等作用[2-5]。食用此菌发酵酸乳能促进钙的吸收，增加骨密度和骨矿物质含量减少骨质流失[6-7]。由于瑞士乳杆菌具有这些益生保健功能，使得此菌具有较好的应用市场，因此提高其产量以及菌粉活菌含量比较具有研究意义。

有研究表明，瑞士乳杆菌在发酵过程中极易自溶，不适于冷冻干燥制备发酵剂[8-9]，本研究针对分离自内蒙古传统酸奶酪中的一株瑞士乳杆菌LH-G51，对其发酵培养基、保护剂进行筛选，并进行小试验证及工艺优化，来提高其冻干菌粉活菌数，再进行中试放大，为后续瑞士乳杆菌的生产应用提供重要的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 瑞士乳杆菌LH-G51，由润盈生物工程(上海)有限公司菌种保藏中心提供。

1.1.2 基础培养基 MRS：葡萄糖 20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二胺2 g/L、乙酸钠5 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.19 g/L、吐温-80 1 g/L。

1.1.3 计数培养基 MRS，0.8 g/L琼脂粉。

1.1.4 冷冻干燥保护剂 选取工厂生产所用5种乳杆菌冷冻干燥保护剂A、B、C、D、E(表1)。

表1 瑞士乳杆菌LH-G51冻干保护剂主要成分 单位：g/L

1.2 仪器与设备

15 L、100 L全自动机械搅拌发酵罐，上海佰仑公司；UV-2102C型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；FD8-6型真空冷冻干燥机，上海颖汉化工；冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化与接种发酵 将真空冷冻保藏的LH-G51菌株接种于MRS培养基中于37℃培养12 h，并传代2次。按照3%的接种量接种，接种后的发酵培养基放置于37℃恒温培养箱中培养12 h后检测菌体生长情况。

1.3.2 菌浓度测定 取1 mL发酵液稀释至一定浓度，于600 nm下用紫外分光光度计测定吸光值。

1.3.3 活菌检测 采用平板倾注法，取0.5 mL(或0.5 g)待测样品溶解于4.5 mL无菌生理盐水中震荡均匀，梯度稀释至一定浓度后倾注平板，每个梯度取3个平行样，37℃培养48h后统计菌落总数。

1.3.4 冻干粉制备 发酵结束后，采用冷冻离心机对发酵液进行离心，离心条件：温度4℃、转速7 000 r/min、时间10 min，离心后菌泥和保护剂按照1∶2进行乳化及真空冷冻干燥，冻干机参数为：冷阱温度-80℃，真空度1 mTorr。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

将分离得到的乳杆菌LH-G51进行培养以及生理生化鉴定，观察菌落形态和菌体形态，初步确定LH-G51为瑞士乳杆菌。

取LH-G51培养液提取细菌总DNA，扩增16S rRNA基因，测定PCR 产物全序列，测得序列进行Blast比对，图1结果显示，该菌株与GenBank中的瑞士乳杆菌CNRZ32相似性为99%，确定乳酸菌LH-G51为瑞士乳杆菌。

图1 LH-G51和瑞士乳杆菌CNRZ32的BLAST比对

2.2 培养基优化

2.2.1 不同碳氮源对LH-G51的影响 碳源及氮源对乳酸菌有着重要作用，是构成细胞物质的基础，为乳酸菌生长繁殖提供能量来源，氮源也是组成乳酸菌蛋白质和核酸的核心元素[10]。本研究在基础培养基MRS的基础上，碳氮源添加量不变，改变碳源及氮源的种类进行发酵。由图2(A)可知，以葡萄糖为单一碳源时生长效果优于其他3种碳源，因此选用葡萄糖为LH-G51培养的最优碳源。由图2(B)可知，不同氮源对LH-G51的生长影响显著，酵母膏及大豆蛋白胨对促进LH-G51的生长效果最明显，其原因可能是这两种氮源物质中的氮是以氨基酸、肽小分子形式存在，因此在菌体生长过程中更容易被利用吸收[11]。A.Amrane的研究[12]也证明，培养基中提高酵母膏的添加量能促进瑞士乳杆菌的生长。

注：(A)图中，a-乳糖、b-葡萄糖、c-蔗糖、d-低聚半乳糖；(B)图中，A-酵母膏、B-蛋白胨、C-牛肉浸粉、D-胰蛋白胨、E-大豆蛋白胨、F-MRS对照图2 不同碳氮源培养基对LH-G51生长的影响

图3 不同微量元素对LH-G51生长的影响

2.2.2 碳氮源添加量正交试验 以对LH-G51生长促进作用较大的葡萄糖、大豆蛋白胨和酵母膏为因素，采用L9(33)正交试验，优化此三种成分的添加量，以活菌数为判断指标，因素水平表见表2。从表3中的极差分析结果可知：根据试验结果所得到的优化复合碳氮源配比为A2B3C1，即大豆蛋白胨10、酵母膏15 g/L、葡萄糖20 g/L。

表2 正交试验因素水平 单位：g/L

2.2.3 微量元素对LH-G51的影响 Mg、Mn、Fe、Cu、Zn等某些微量元素是微生物活性物质构成的重要成分之一，在其代谢过程中这些微量元素还能够激活微生物菌体内的酶类物质，且不同菌株对微量元素的需求不同[13-14]，因此需对其添加种类及添加量进行优化。由图3可以看出，添加不同量不同种的无机盐对LH-G51发酵液的活菌数有不同影响，Cu2+对LH-G51有抑制作用，Fe2+、Zn2+促进作用不明显，Mg2+、Mn2+对LH-G51的生长具有较明显促进作用，其中，MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O的最适添加量分别为 250、50mg/L。

表3 正交试验结果

2.3 LH-G51冻干保护剂筛选

发酵结束后发酵液离心所得到菌泥，按照表1中的5种保护剂进行乳化及冻干，由表4、表5可知，采用保护剂B乳化冻干的LH-G51菌粉活菌数最高，通过方差分析及Dun-can新复极差法进行多重比较可知，保护剂B与其他4种保护剂差异极显著，因此，选用保护剂B配方为LH-G51的较优保护剂。

表4 5种冻干保护剂冻干LH-G51菌粉检测结果

注：标有同一字母的数据间差异不显著；方差分析采用Dun-can新复极差法

表5 5种冻干保护剂冻干LH-G51菌粉方差分析

注：F0.05(3，4)=5.192

2.4 LH-G51生产工艺研究

2.4.1 LH-G51在优化的培养基中的生长特性 采用优化的培养基对LH-G51进行15L发酵罐小试试验验证以及发酵工艺优化，选择合适的发酵参数；再进行100L发酵罐中试放大，发酵过程中恒控pH 5.8±0.1。发酵参数为：罐温37±1℃，通氮气保压，罐压0.02～0.05MPa，接种后每隔1 h取样检测LH-G51生长情况及发酵液活菌数，绘制LH-G51的生长曲线。由图4可以看出，LH-G51在优化的培养基及工艺条件下发酵，菌浓度在10 h达到最大值，此时OD600值为10.18，发酵液活菌数达到4.36×109CFU/mL，之后进入稳定期。

图4 瑞士乳杆菌LH-G51在发酵罐中的生长曲线

2.4.2 LH-G51放罐时间的选择 为了保证得到活性最高的冻干菌粉，从发酵9 h开始，每隔1 h取发酵液样品进行离心、乳化及冻干，得到瑞士乳杆菌LH-G51的冻干菌粉，对菌粉进行活菌计数，由表6、表7检测结果及方差分析数据可知，9～11 h所得菌粉样品的活菌数相当，12 h后活菌数下降，考虑到生产成本以及菌泥产量，选择10 h即对数生长期末期进行放罐收获比较合适，提前放罐收率减低，推迟放罐菌会老化从而导致菌粉活力及稳定性下降。

表6 瑞士乳杆菌LH-G51不同取样时间冻干菌粉活菌数

表7 5种冻干保护剂冻干LH-G51菌粉方差分析

注：F0.05(3，4)=6.591

3 结论

单因素及正交试验确定LH-G51最适培养基(/L)：葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母膏15 g、无水乙酸钠5 g、K2HPO42 g、柠檬酸氢二铵2 g、MgSO4·7H2O 250 mg、MnSO4·5H2O 50 mg、Tween-80 1 g。LH-G51在此培养基中，经过小试15 L发酵罐优化工艺后，于100 L发酵罐中进行中试，通氮气保压，罐压0.02～0.05 MPa，罐温37±1℃，恒控 pH5.8±0.1，培养10 h后培养基活菌数可达到4.36×109CFU/mL。此时放罐所得的菌泥采用优化的保护剂B进行乳化冻干，得到冻干菌粉活菌数为4.21×1011CFU/g，比在MRS中培养所得的菌粉(8.6×1010CFU/g)提高了近5倍，为瑞士乳杆菌冻干菌粉进一步应用奠定了基础。◇

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(责任编辑 李婷婷)

Production Process of Lyophilized Powder forLactobacillushelveticusLH-G51

LEI Dan，HAN Di，JIANG De-yi，GAN Dan

(BIOGROWING (SHANGHAI)CO.，LTD，Shanghai 201700,China)

ObjectiveTo optimize the production process of freeze-dried powder ofLactobacillushelveticusLH-G51.Method Optimized conditions for fermentation medium formula，freeze-drying protective agents and production processing were screened by using single factor and orthogonal experimental design.ResultAmong different factors，carbon sources，nitrogen sources and micro-elements were the key factors during the cell culture stage.The optimal culture medium for LH-G51 was glucose 20 g/L，soy peptone 10 g/L，yeast extract 15 g/L，MgSO4·7H2O 250 mg/L，MnSO4·H2O 50mg/L，the best protective agents was B.ConclusionUnder the optical conditions，the cell number of lyophilized powder of LH-G51 reached up to 4.21×1011CFU/g。

Lactobacillushelveticus；production process；protective agents；lyophilized powder

雷丹(1983— )，女，硕士，研发工程师，研究方向：益生菌制备工艺。

甘聃(1981— )，男，博士，技术研发总监，研究方向：食品营养与健康。