UPLC同时测定双黄连粉针剂中黄芩苷、绿原酸、连翘苷成分的含量

张丹丹，冯程，顾媛媛，谭福柱，陈大忠*

(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

UPLC同时测定双黄连粉针剂中黄芩苷、绿原酸、连翘苷成分的含量

张丹丹1，冯程1，顾媛媛1，谭福柱2，陈大忠1*

(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的:建立超高效液相色谱法同时检测双黄连粉针剂中黄芩苷、连翘苷、绿原酸三种成分含量的测定方法。方法:采用Acquity UPLC TM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，乙腈-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱，柱温为40℃，流速为0.3 ml/min。结果:黄芩苷、连翘苷、绿原酸分别在1.021 6～10.216、0.611 8～6.118、0.402 4～4.024 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数分别为0.999 6、0.999 3、0.999 5，3种成分平均回收率均符合含量测定要求。结论:本法高速、准确、简单易行，已成功用于实际样品的分析，可为双黄连粉针剂的质量控制提供参考方法。

双黄连粉针剂;超高效液相色谱法;黄芩苷;连翘苷;绿原酸;含量测定

双黄连粉针剂(冻干)是由黄芩、金银花、连翘等中药提取纯化经喷雾干燥制成的粉针剂，具有清热解毒，轻宣透邪的功效，在临床上经常加入适当溶媒供静脉注射使用，现已广泛用于肺炎、扁桃体炎、上呼吸道感染、急性肾盂肾炎、急性胆囊炎、小儿肠炎、婴幼儿肺炎、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒三型感染等多种疾病［1-2］。然而双黄连粉针剂是个复杂组群，还有很多化合物存在同系物或同分异构体的形式，普通的分析方法不足以有效控制其质量。《中国药典》通过3种独立的HPLC-UV法分别测定双黄连粉针剂中黄芩苷、连翘苷、绿原酸的含量，但连翘苷则必须需要经氧化柱等处理，整个过程很麻烦。制剂现行标准中规定了测定绿原酸、黄芩苷的含量，但是没有连翘的含量指标显示。想要测定的这两种成分却必须要采用不同的流动相系统分别进行检测，实际操作也比较麻烦，工作效率较低。我们采用UPLC法进行梯度洗脱同时联合多波长检测同时对其中含量相对较高的三种成分进行含量测定，为高效控制和评价双黄连粉针剂的质量提供有效的方法。

高效液相色谱法［3-5］具有易操作、灵敏度和稳定性高等特点，但存在溶剂用量大，耗时长等缺点。UPLC是近几年推出的一种新的液相色谱技术，作为中药成分分析中定性和定量的有力工具，具有分析速度和分辨率高，专属性强，定性能力强等优点，较常规HPLC有了较大的提升，较好地分离效率、峰容量及灵敏度，显著缩短分析时间并减少溶剂损耗，使其更适合于药物复方制剂及复杂样品的分析研究。

1 仪器与试药

美国Waters Acquity UPLCTM超高效液相色谱仪(包括在线真空脱气机、自动进样器、四元梯度泵、二极管阵列检测器和柱温箱);MassLynx V4.1色谱工作站;JA-2003精密电子天平(上海市良平仪器厂); KH-300E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

连翘苷对照品(批号110821-201213，供含量测定用)、黄芩苷对照品(批号110715-201314，供含量测定用)、绿原酸对照品(批号110753-201314，供含量测定用)均购自中国食品药品检定研究院;双黄连粉针剂(哈药集团中药二厂，规格:600 mg/支，批号1409419、1409418、1409417、1409416、1409415、1409414、1409413、1409410、1409407、1409406);甲酸(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司);乙腈(色谱纯，美国Fisher公司);水为屈臣氏蒸馏水;其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱 柱为 ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水，流速为0.3 mL/min;柱温为40℃;进样量:3 μL;进行梯度洗脱(见表1)。

2.2 溶液的制备

表1 梯度洗脱表

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取黄芩苷、连翘苷、绿原酸对照品适量，用50%的甲醇溶解定容于10 mL的棕色容量瓶中，制得对照品溶液(贮备溶液);精密量取绿原酸、连翘苷、黄芩苷对照品，加入50%甲醇溶液分别制成每1 mL含绿原酸40 μg、连翘苷60 μg、黄芩苷100 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

从每批药品中随机取本品5支，混匀，量取本品50 mg，精密称定，加入50%的甲醇溶液20 ml，置于25 mL的具塞锥形瓶中超声处理20 min，补足重量，用50%的甲醇定容于 25 mL容量瓶中，摇匀，再过0.22 μm的微孔滤膜，即得。

2.3 系统性试验

在“2.1“项下色谱条件，黄芩苷，绿原酸，连翘苷的理论塔板数均大于2 500，各个指标的成分也分离的较好。色谱图见图1～2。

图1 混合对照品溶液的UPLC色谱图

图2 供试品溶液的UPLC色谱图

2.4 线性考察

分别精密量取上述混合对照品贮备溶液1、2、4、6、8、10 mL分别置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件，分别进样10 μL。记录色谱图，分别以峰面积(Y)作为纵坐标，对照品进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线并计算相应的回归方程，见表2。

表2 各组分线性回归方程

2.5 精密度试验

取同一批次供试品溶液(批号1409407)，按“2.1”项下色谱条件，“2.2.2”项下制备供试品溶液的方法，连续进样6次，每次5 μL，记录各峰面积，分别计算其RSD值，结果黄芩苷、连翘苷和绿原酸峰面积的RSD值分别为1.72%、2.02%、2.34%，表明仪器具有良好的精密度。

2.6 重复性试验

取供试品双黄连粉针剂(批号1409407)，精密称定6份，每份约 20 mg，按“2.1”项下色谱条件，“2.2.2”项制备供试品溶液的方法，分别进样5 μL，连续进样6次，计算各成分含量，黄芩苷、连翘苷和绿原酸含量的RSD值分别为1.45%、1.98%、2.26%，表明该方法具有良好的的重复性。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液(批号1409407)，分别于0、2、4、6、8、12、24 h内进样，按“2.1”项下色谱条件，“2.3”项制备供试品溶液的方法，分别进样5 μL，记录各峰面积，黄芩苷、连翘苷和绿原酸峰面积的RSD值分别为1.33%、1.81%、2.12%，表明该方法具有较好的稳定性。

2.8 回收率试验

取双黄连粉针剂(批号1409407)粉末10 mg，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中，加入适量的对照品溶液，按“2.2.2”项下制备供试品溶液的方法，平行制备6份供试品溶液，每次进样5 μL，计算回收率，见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=6)

2.9 样品测定方法

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10 μL按“2.1”项下色谱条件，“2.2.2”项下制备供试品溶液的方法，注入超高效液相色谱仪进行检测，根据色谱图按外标两点法计算其含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果(mg/支，n=3)

3 结果与讨论

在通过比较洗脱效果及酸度影响的考察中，发现乙腈具有良好的洗脱效果，而且当甲酸的浓度为0.1%时色谱峰的峰型较满意，故流动相选择乙腈-0.1%甲酸进行试验。在考察色谱条件时，选用了既能缩短分离时间，又能提高分离效果的梯度洗脱方法，进行试验。在试验中发现，由于水溶液的稳定性差，存在含量衰减的现象，在换用50%甲醇［6］时，发现衰减现象消失，置于室温下，可放置72 h符合检测的要求。在对溶剂的考察中，发现对50%的甲醇通过超声处理和加热回流处理的提取效果基本无差异，考虑节约时间等因素，所以采用了50%的甲醇超声处理20 min。

本文建立了快速、简便的方法，用超高效液相色谱同时测定双黄连粉针剂中黄芩苷，绿原酸、连翘苷三种药效成分含量，有机溶剂消耗较少，分析时间缩短为普通高效液相色谱的1/3，既减少了环境污染，又降低了成本。本法适用于双黄连粉针剂三种成分的高效快速测定，可以为双黄连的质量控制和药物疗效、化合物含量研究、药代动力学等相关研究提供新的参考方法和科学依据。

［1］张洁，马百平，赵阳，等.双黄连粉针剂指纹图谱中特征峰的组成药味归属及定性［J］.中成药，2005，27(12):1365-1369.

［2］曲敬来，高雪，陈生，等.双黄连冻干粉剂鼻腔冲洗在上气道咳嗽综合征治疗中的应用［J］.中医药学报，2015，43(6):79-81.

［3］赵丽芬，韩省力.高效液相色谱法测定双黄连粉针剂中黄芩苷的含量［J］.中医药信息，2015，32(6):31-33.

［4］笔雪艳，王宪平，张清波，等.HPLC-UV-ELSD联用法测定双黄连系列制剂中连翘含量并同时检查山银花［J］.药物分析杂志，2014，34(1):104-107.

［5］梁军，杨琦，夏永刚，等.双黄连口服液的HPLC指纹图谱研究［J］.中医药学报，2013，41(6):24-25.

［6］孙永慧，李文春.HPLC同时测定双黄连粉针剂中5种成分的含量［J］.中成药，2010，32(1):65-68.

Simultaneous Determination of Baicalin，Chlorogenic Acid，Forsythin in Shuanghuanglian Powder Injection by UPLC

ZHANG Dan-dan1，FENG Cheng1，GU Yuan-yuan1，TAN Fu-zhu2，CHEN Da-zhong1*
(1.Research Institute of Chinese Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To establish a rapid UPLC method for simultaneously determining baicalin，phillyrin，chlorogenic acid in Shuanghuanglian powder for injection.Methods:UPLC assay was carried out by using the Acquity UPLCTMBEH C18 column(2.1 mm×50 mm，1.7 μm).The mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid，solution for gradient elution.The column temperature was 40℃.The flow rate was 0.3 ml/min.Results:The linear ranges of baicalin，forsythin and chlorogenic acid in the range of 1.021 6～10.216，0.611 8～6.118，0.402 4～4.024 μg/mL respectively.The three components showed a good linear correlations(r=0.999 6，0.999 3，0.999 5).The average recoveries of three components are in line with the requirement of determination.Conclusion:The method is efficient，accurate and simple，and has been used for the analysis of real samples successfully，which can provide a reference for the quality control of Shuanghuanglian powder for injection.

Shuanghuanglian powder-injection;UPLC;Baicalin;Phillyrin;Chlorogenic acid;Content determination

R28

A

1002-2406(2017)02-0039-03

黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(No.GC13C109);“重大新药创制”科技重大专项-双黄连粉针剂技术改造(No.2011ZX09201-201-15)

张丹丹(1991-)，女，硕士，主要研究方向:中药物质基础成分研究和新药研究。

陈大忠*(1970-)，男，研究员，硕士研究生导师，主要研究方向:中药物质基础成分研究和新药研究。

2016-02-20

修回日期:2016-03-10