地龙提取液中蛋白质的稳定性研究

段晓杰，罗世林，汪文琪，王雄飞，汤化琪，孙毅坤

(北京中医药大学，北京 100102)

地龙提取液中蛋白质的稳定性研究

段晓杰，罗世林，汪文琪，王雄飞，汤化琪，孙毅坤*

(北京中医药大学，北京 100102)

目的:对影响地龙提取液中蛋白质稳定性的因素进行研究。方法:通过考马斯亮蓝法建立了地龙提取液中蛋白质的含量测定方法，并考察了温度、pH值、无机盐及有机溶剂等因素对提取液中蛋白质稳定性的影响。结果:在30℃、pH值为7的条件下，提取液中蛋白质的含量最高，而加入无机盐或有机溶剂后蛋白质含量均有所降低。结论:提取液的最佳保存条件为30℃、pH值7，且提取过程中应尽量减少无机盐和有机溶剂的使用。

地龙提取液;蛋白质稳定性;考马斯亮蓝法

地龙又名“蚯蚓”，最初记载于《神农本草经》［1］。该药物性味咸，寒，归肝、脾、膀胱经，具有清热止痉、平肝熄风、平喘通络、利尿的功效［2-6］。课题组前期对断体地龙提取液进行了创伤愈合的研究，结果表明，地龙提取液具有良好的促进创伤愈合的作用，其主要活性成分为小分子蛋白类成分。作为一种蛋白质染料，考马斯亮蓝G-250可在酸性条件下与蛋白质结合形成考马斯亮蓝G-250-蛋白质复合物，其最大吸收峰为595 nm，且吸光度与蛋白质含量呈线性关系［7］，因此可通过考马斯亮蓝法对地龙提取液中的蛋白质进行含量测定，从而观察温度、pH值、无机盐及有机溶剂等［8］对蛋白质稳定性的影响。

1 仪器与试药

万分之一电子天平(北京赛多利斯科学有限公司);冷冻离心机(TGL20M，湘智离心机厂);PHS-3C型酸度计(上海般特仪器制造有限公司);紫外分光光度计(TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司);匀浆机(IKA T10 basic);牛血清白蛋白(AMERSCO); Tris(C4H11NO3，AMRESCO);氯化钠(NaCl，分析纯，北京化工厂);盐酸(分析纯，北京化工厂);考马斯亮蓝G-250(北京欣经科生物);硫酸铵((NH4)2SO4，北京化工厂);其余试剂均为分析纯。

2 地龙提取液的制备

取地龙适量，加入一定量的Tris-HCl缓冲液，冰浴匀浆，离心，取上清液封装好置于4℃冰箱中储存备用。

3 蛋白质的稳定性考察

3.1 蛋白质的含量测定

精密称取牛血清蛋白31 mg，于25 mL容量瓶中定容，摇匀，备用。分别精密吸取牛血清蛋白溶液0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 mL，加Tris-HCl缓冲溶液至0.20 mL后，再加入考马斯亮蓝试剂10 mL，混匀，室温静置5 min，于595 nm处测定吸光度。以牛血清蛋白浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得回归方程A=34.741C-0.002 6(R2=0.996 5)。结果表明牛血清蛋白在0.002 5～0.025 mg/mL浓度范围时浓度与吸光度线性关系良好(见图1)。

图1 牛血清蛋白浓度与吸光度标准曲线

3.2 温度、pH值、无机盐和有机溶剂对蛋白质稳定性的影响

3.2.1 温度对蛋白质稳定性的影响

取地龙提取液7份，每份2 mL，一份置于冰浴中0℃保持5 min，其余6份分别用水浴锅加热至10、20、30、40、50、60℃并保持5 min，测定不同温度下地龙提取液中蛋白质的含量，结果见图2。

图2 温度与蛋白质含量变化曲线

由图2可看出，30℃时地龙提取液中蛋白质含量最高，可能是由于温度过低或过高都会对蛋白的空间结构有一定影响，使之化学性质发生变化、稳定性下降，进而含量降低［9］。其中高温对地龙匀浆蛋白质稳定性的影响更大，在30℃ ～60℃范围内，随温度的升高，地龙提取液中蛋白质含量显著下降。

3.2.2 pH值对蛋白质稳定性的影响

取地龙提取液5份，每份2 mL，分别采用盐酸或1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节提取液的pH值至5，6，7，8，9，于4℃下放置24 h，分别测定其蛋白质含量，结果见图3。

图3 pH值与蛋白质含量变化曲线

当pH值为7时，蛋白质含量最高，pH值为8时蛋白质含量最低。在不同pH值范围内，蛋白质的含量变化也不同。可能是由于蛋白质分子是两性物质，在等电点附近时，水化作用最弱，溶液不稳定［10］造成的。

3.2.3 无机盐对蛋白质稳定性的影响

取地龙提取液4份，每份2 mL。分别加入氯化钠29.20，58.40，87.70，116.90 mg，最终得地龙提取液中氯化钠浓度分别为0.5，1，1.5，2.0 mol/L，振荡，摇匀，于4℃下放置24 h，分别测定其蛋白质含量，结果见图4。

取地龙提取液4份，每份2 mL。分别加入硫酸铵66.10，132.10，198.20，264.30 mg，最终得地龙提取液中硫酸铵浓度分别为0.5，1，1.5，2.0 mol/L，振荡，摇匀，于4℃下放置24 h，分别测定其蛋白质含量结果见图5。

图4 氯化钠浓度与蛋白质含量变化曲线

图5 硫酸铵浓度与蛋白质含量变化曲线

由图4～5可知，无机盐的浓度与地龙提取液中蛋白质含量呈负相关，即地龙提取液中蛋白质含量随着氯化钠和硫酸铵浓度的增加而减少。分析原因可能如下:蛋白质是由亲水性和疏水性氨基酸组成，蛋白质疏水基大部分存在于蛋白质分子内部，暴露在外的疏水残基和亲水残基决定了蛋白质分子的溶解度［10］。当往溶液中加入中性盐离子时，蛋白质疏水基相互作用减弱，易发生盐析而使蛋白质溶解度降低。同时离子的作用降低了蛋白质大分子离子的活性又可使其溶解度提高［11］。

3.2.4 有机溶剂对蛋白质稳定性的影响

取地龙提取液6份，每份2 mL。分别加入甲醇0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，最终得地龙提取液中甲醇浓度比(体积比)分别为0%，10%，20%，30%，40%，50%，振荡，摇匀，于4℃下放置24 h，分别测定其蛋白质含量，结果见6。

取地龙提取液6份，每份2 mL。分别加入乙腈0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，最终得地龙提取液中乙腈浓度比(体积比)分别为0%，10%，20%，30%，40%，50%，振荡，摇匀，于4℃下放置24 h，分别测定其蛋白质含量，结果见7。

图6 甲醇浓度与蛋白质含量变化曲线

图7 乙腈浓度与蛋白质含量变化曲线

由图6～7可以看出，地龙提取液中蛋白质含量与有机溶剂体积分数也呈负相关。地龙提取液中蛋白质含量随甲醇和乙腈体积分数的增大而降低。可能是由于有机溶剂能降低溶液的电解常数，增加蛋白质分子不同电荷间的引力，使之聚集析出;且有机溶剂可与水作用，破坏蛋白质分子表面水化层，使蛋白质分子脱水聚集析出，从而使蛋白质含量降低。

4 讨论与总结

本实验通过测定不同温度、不同pH值、不同浓度无机盐以及不同浓度有机溶剂下蛋白质的含量来考察蛋白质的稳定性。结果发现，当地龙提取液在30℃左右保存时，测得蛋白质的含量最高;当溶液pH值为7时，活性较好，测得蛋白质的含量也最高。而无机盐和有机溶剂则会不同程度的降低地龙提取液中蛋白质的稳定性。因此实验中将地龙提取液保存在30℃下、提取液pH值控制在7左右为宜，且应尽量避免或减少对无机盐及有机溶剂的使用。

［1］张继喜，王海平，吕芳，等.中药地龙药用分析及研究进展［J］.药物与人，2014，27(3):16-17.

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Stability of Protein in Earthworm Extract

DUAN Xiao-jie，LUO Shi-lin，WANG Wen-qi，WANG Xiong-fei，TANG Hua-qi，SUN Yi-kun*
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

Objective:Factors influencing the stability of the protein in earthworm extract were researched in this article.Methods:Braford was adopted for determination of protein to observe the influences which temperature，pH，inorganic salt and organic solvents had on the stability of protein.Results:It showed that the protein was the stablest under 30℃ and pH=7 and became weaker when inorganic salt and organic solvents were added.Conclusion:The optimal preservation condition for earthworm extract is 30℃ and pH=7，and inorganic salt and organic solvents should be limited in the extraction process.

Earthworm extract;Stability of protein;Braford

R28

A

1002-2406(2017)02-0031-03

国家自然科学基金面上项目(No.81373942)

段晓杰(1991-)，女，北京中医药大学2015级中药分析专业硕士研究生。

孙毅坤*(1965-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向:药品质量控制。

2016-08-16

修回日期:2016-09-10