关于杜仲3类有效成分检测中应用多波长高效液相色谱法测定的结果分析

2017-03-28陈转艮丁少波梁淑贞陈润添

中国实用医药 2017年1期

陈转艮+丁少波+梁淑贞+陈润添

【摘要】目的研究采用多波长高效液相色谱法测定杜仲3类有效成分的效果。方法采用Dionex C18柱以及流动相组成一种甲醇-0.1%磷酸水来进行梯度洗脱操作，对杜仲中的3类有效成分进行测定，分析测定结果。结果进行色谱峰分离的效果较好，多波长高效液相色谱法能够对杜仲中的桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸以及京尼平苷酸进行同时测定，其中桃叶珊瑚苷的含量为0.67%，松脂醇二葡萄糖苷的含量为0.45%，绿原酸的含量为3.16%，京尼平苷酸的含量为1.12%。结论多波长高效液相色谱法测定杜仲3类有效成分的效果显著，操作简单，具有较好的重现性，能够为杜仲内在质量的控制提供科学有效的依据。

【关键词】多波长高效液相色谱法；杜仲；有效成分

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.01.096

杜仲属于一种名贵的中药材，具有利尿、安胎、坚筋骨以及降血压等诸多功效[1]。该药物的主要化学成分包括杜仲胶、多糖、黄酮、苯丙素类、环烯醚萜类以及木脂素类等。部分学者对杜仲中的桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷以及京尼平苷酸等进行了测定，这4种物质属于杜仲的主要药效成分，可以将其概括为3大类，在测定上具有较大的难度[2-6]。本研究主要探讨多波长高效液相色谱法测定杜仲3类有效成分的效果，总结如下。

1 仪器与试剂

1. 1 仪器超声波清洗器（频率为25 kHz，功率为250 W）；FZ102型微型植物试样粉碎机；precisa 分析天平；UltiMate 高效液相色谱仪。

1. 2 试剂二次蒸馏水；甲醇（色谱纯）；杜仲皮（产地：山东）；京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸对照品。

2 方法

2. 1 制备供试品溶液称取50 g杜仲药材，将其研制成为絮状粉末，取2 g左右的样品粉末，将其放置在具塞锥形瓶中，将60 ml 75%的甲醇加入，对其进行称重，进行30 min的超声提取，冷置，对其进行称重，将减失的重量补足，然后再将其滤过，药渣再重复上述操作一次。进行两次滤液处理之后将其减压浓缩，并且采用相同浓度的甲醇溶液对其进行定容，一直到20 ml，对其进行均匀摇晃，采用0.45 μm的微孔滤膜对其进行滤过，最后获得供试品溶液。

2. 2 制备对照品溶液称取适量的京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸对照品，将其放置在容量瓶中（10 ml），将色谱纯甲醇加入到其中，将其溶解，并将其稀释到刻度，对其进行摇晃，将其制备成为对照品混合储备液，具体的浓度：桃叶珊瑚苷为0.70 g/L、松脂醇二葡萄糖苷为0.50 g/L、绿原酸为3.32 g/L、京尼平苷酸为1.20 g/L，采用冷藏的方式进行保存。

2. 3 色谱具体条件进样量为10 μl；检测波长分别为320、280、240、210 nm；柱温为25℃；流速为1.0 ml/min；流动相为甲醇-0.1% 磷酸水梯度洗脱；色谱柱为 Dionex C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）。

3 结果与分析

3. 1 优化提取条件提取方法采用回流法与超声法，根据已经拟定好的色谱条件，分别采用两种提取方式对提取的样品进行测定，将4种有效成分的峰面积之和作为考察的具体指标，结果显示出两种提取方法不具备较大的差异性，但是超声提取这种方式具有快捷、简单等优点，所以最终选用超声提取法对样品进行提取。

3. 2 优化超声提取条件称取2 g杜仲药品，一共有9份，对超声提取杜仲中主要活性成分提取时间、提取次数、料液比以及溶解浓度等影响因素进行 L9（34）正交试验[7-10]，结果显示最好的提取方案為：料液比1 g/30 ml、75%甲醇、进行3次超声提取，将每次提取的时间控制在30 min。其次，结果显示料液比对杜仲中主要成分的提取影响最大，其次为提取次数、甲醇浓度、反应时间。

3. 3 优化色谱条件检测波长的选择：对样品采用PDA-3000光电二极管进行全波长扫描，为了能够达到干扰小、吸收强的目的，对京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸各物质的光谱性质差异进行利用，将3D-plot图谱作为依据，最终决定采用四波长进行检测[11-13]，具体为：320 nm测定绿原酸、280 nm测定松脂醇二葡萄苷、240 nm测定京尼平苷酸、210 nm测定桃叶珊瑚苷。在这种条件下，能够获得最多的图谱信息量，并且具有较好的峰形，基线平稳，溶剂受到的干扰少，能够对各种物质进行准确的分析。

优化流动相：对甲醇-乙腈、乙腈-水、甲醇-水分别进行梯度洗脱比较，结果显示，在甲醇-水位流动相时，分离较好，出峰较多，但是会有拖尾现象出现，所以将磷酸快加入到流动相中，以此来达到消除拖尾的目的。结果显示，甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脱时，能够获得理想的色谱峰分离度以及峰形，具有较好的程序稳定性。

3. 4 方法学考证线性关系考察：采用流动相溶液将对照品储备液稀释，并且配备成为对照品系列溶液，桃叶珊瑚苷：0.08、0.17、0.35、0.70、1.40 g/L；松脂醇二葡萄糖苷：0.06、0.12、0.25、0.50、1.0 g/L；绿原酸：0.42、0.83、1.66、3.32、6.64 g/L；京尼平苷酸：0.15、0.30、0.60、1.20、2.40 g/L。分别进样5 μl，对其进行55次平行测定，结果显示，京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸的峰面积和其进样浓度具有良好的线性关系。

方法的稳定性、重复性以及回收率分析：选取相同批次的5份供试品，采用供试品溶液制备以及检测方法对其进行测定，对其重复性的RSD进行计算，结果显示，在24 h内，试品溶液具有较好的稳定性，并且实验的重复性好。

3. 5 杜仲样品测定取约2 g的杜仲样品粉末，对其进行精密称定，放置在具塞锥形瓶中，采用优化后的提取方案提取样品，并且在最优色谱条件下对其进行测定，结果分别在320、280、240、210 nm的波长条件下进行检测，最终结果显示，桃叶珊瑚苷的含量为0.67%，松脂醇二葡萄糖苷为0.45%，绿原酸为3.16%，京尼平苷酸为1.12%。这种波长能够对各种化合物的含量进行准确的测定。

4 讨论

本研究采用多波长高效液相色谱法对杜仲3类有效成分进行测定，可以在相同的色谱条件下采用不同波长对其进行检测，能够有效实现同时定量测定多个成分、多类组分的目的，不仅在很大程度上提高了检测效率，而且其精密度与准确度能够与要求相符合。与此同时，进行方法学考察、色谱条件优化以及提取条件优化之后，对提取条件进行了最终确定[14， 15]。最后，实验对样品中4种成分的含量采用多波长同时检测的方式进行了测定，具有较高的可靠性与精确性。

综上所述，多波长高效液相色谱法测定杜仲3类有效成分的效果显著，操作简单，具有较好的重现性，能够为杜仲内在质量的控制提供科学有效的依据。

参考文献

[1] 刘大旭，高晓波，祁永华，等.杜仲有效成分β-萘黄酮对UVB诱导人皮肤成纤维细胞光老化保护作用研究.中医药学报， 2016， 44（3）：41-43.

[2] 杨林军，黄文平，吴永忠，等.杜仲板皮和枝皮中4种有效成分差异性比较.中草药， 2015， 46（4）：584-587.

[3] 戚向阳，陈维军，张声华. 反相高效液相色谱法测定杜仲中京尼平苷、京尼平苷酸及绿原酸的含量. 药物分析杂志， 2000（1）： 22-24.

[4] 石少澜，王祝举，邵爱娟，等. 高效液相色谱法测定杜仲皮中绿原酸的含量. 中国中药杂志， 2005， 30（9）：715-716.

[5] 冯薇薇，郭方遒，范岚，等. 多波长高效液相色谱法同时测定杜仲中三类有效成分. 现代中药研究与实践， 2013（2）：13-16.

[6] 冯薇薇. 杜仲中化学成分的提取、分离、纯化与测定. 中南大学， 2013.

[7] 李艳艳. 高效液相色谱法测定杜仲中主要成分和食品中大豆异黄酮. 西南大学， 2010.

[8] 伍庆，王兴宁，张明时，等. 高效液相色谱法同时测定杜仲叶药材中芦丁等3種黄酮类有效成分的含量. 时珍国医国药， 2009， 20（5）：1186-1187.

[9] 黄勤挽，王瑾，苏娟，等. 双波长HPLC法同时测定杜仲雄花中3种成分的含量. 中国药房， 2011， 22（27）：2565-2567.

[10] 阿来·赛坎，文娥，田树革. 高效液相色谱法同时测定杜仲叶中4种有效成分的含量. 国际药学研究杂志， 2016， 43（3）：571-574.