沙苑子对运动大鼠海马氨基酸类神经递质代谢的调控作用

刘志刚，聂玉芝，刘琴

沙苑子对运动大鼠海马氨基酸类神经递质代谢的调控作用

刘志刚1，聂玉芝2，刘琴1

目的：研究沙苑子对运动大鼠海马氨基酸类神经递质代谢的影响。方法：SD大鼠随机分为安静对照组（Contrnl group，C组）、一般训练对照组（training control group，TC组）、强化训练组（intensive training group，IT组）和强化训练沙苑子干预组（SAC intervention and intensive training group，SACIT组）。第8周始取材，分离大鼠海马组织，处理后用自动氨基酸分析仪进行测试。各组数据进行单因素方差分析，以S-N-K检验并计算效应量Cohen’s d值。结果：谷氨酸（Glu）：与C组相比，其他3组极显著升高（P＜0.01），与TC组相比，IT组显著升高（P＜0.05）。天冬氨酸（Asp）：与C组相比，其他3组极显著降低（P＜0.01），与TC组相比，IT组和SACIT组极显著降低（P＜0.01）。γ-氨基丁酸（GABA）：IT组比其他3组极显著升高（P＜0.01），TC组比C组和SACIT组极显著升高（P＜0.01），SACIT组比C组极显著升高（P＜0.01）。甘氨酸（Gly）：C组和SACIT组比IT组极显著降低（P＜0.01），TC组和SACIT组比C组极显著升高（P＜0.01），SACIT组比TC组显著降低（P＜0.05）。脯氨酸（Pro）：IT组比C组显著升高（P＜0.05），比TC组极显著升高（P＜0.01）。Glu/GABA比值：TC组比C组显著降低（P＜0.05），IT组比C组极显著降低（P＜0.01），SACIT组比TC组和IT组显著升高（P＜0.05）。结论：沙苑子能显著提高运动大鼠海马Glu和Asp含量而降低GABA、Gly和Pro水平，提高Glu/GABA比值，使大鼠海马整体兴奋性上升，有效对抗运动性中枢抑制和中枢疲劳。

沙苑子；海马；氨基酸；神经递质

沙苑子（semen astragali complanati，SAC）是中国特有的豆科黄芪属植物扁茎黄芪（astragatus complanatus）的种子。扁茎黄芪分布于中国大陆的东北、华北、四川、陕西、江苏、甘肃、宁夏、河南等地，生长于海拔1 000～1 700 m的地区。中医认为，沙苑子可以温补肝肾，有固精、缩尿的功效［4］。化学分析表明，沙苑子含有氨基酸、黄酮类、三萜类等多种生物活性物质，具有保肝、增强免疫和抗疲劳等作用［1，3］。研究表明，脑内氨基酸类神经递质代谢失衡是导致运动性中枢疲劳的重要因素［6］。不同强度的运动对海马神经元电生理活动可产生不同影响，运动疲劳可显著改变大鼠海马CA1区神经元的诱发和自发电活动，抑制神经元的兴奋性，可引起大鼠海马出现长时程抑制（long-term depression，LTD），并因此降低其学习和记忆能力［5］。本实验通过检测运动大鼠海马部位氨基酸类神经递质的代谢变化，研究沙苑子对运动大鼠中枢疲劳的影响和对氨基酸类神经递质的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

选用SPF级（specific pathogen free）SD（Sprague Dawley）雄性健康大鼠48只，3月龄，体重220±20 g。由陕西中医药研究所动物饲养中心提供（动物合格证编号：陕医动字第08-005），国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由摄食、饮水。环境温度20℃～25℃，相对湿度40%～60%，噪声不大于50 dB，自然光照明。沙苑子采用商品药物颗粒制剂，辅料为蔗糖、糊精（辅料仅起填充、粘合和赋形作用，成分配比为：60%沙苑子浸膏∶蔗糖∶糊精=1∶3∶3，干燥后制成商品颗粒），由陕西省恒心堂制药有限公司提供。

1.2 主要仪器

德国Hettich MIKRO 22R冷冻离心机；天津泰斯特DK-98-1A恒温水浴锅；德国Sartorius BP-310S电子天平；杭州段氏DSPT-202型大鼠跑台；上海申安LDZX-30KBS高压灭菌锅；广东科龙BCD-272电冰箱；德国Eppendorf微量移液器；美国Beckman 121B氨基酸自动分析仪；日立U-3900紫外分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 动物分组

大鼠随机分为4组，每组12只：安静对照组（Control group，C组），不进行任何训练；一般训练对照组（training control group，TC组），5周适应训练后再进行2周一般训练；强化训练组（intensive training group，IT组），5周适应训练后再进行2周强化训练；强化训练沙苑子干预组（SAC intervention and intensive training group，SACIT组），5周适应训练后再进行2周强化训练，同时灌胃沙苑子制剂。

1.3.2 运动模型

采用Benford运动模型稍加改动。适应实验环境1～2天后开始训练，以递增强度的方式在跑台上运动，跑台水平放置，零坡度。训练时间固定在每天18：00～18：30之间。从训练第1周起，每周递增速度，分别为15 m/min、22 m/min、27 m/min、31 m/min、35 m/min。每次训练20 min，每周5天，共训练5周。第5周后按以下方案进行训练：

一般训练：第6、7周（每周7天）实验动物以35 m/min速度，在零坡度跑台上训练20 min。

强化训练：第6、7周（每周7天）实验动物以35 m/min速度，在零坡度跑台上训练30 min。

造模共7周，于第8周始取材。

1.3.3 给药方案

按照实验动物与人用药量的换算关系以及参考文献［10］，确定SACIT组大鼠每日固定的时间（9：00～9：30）按1.8 g/kg的给药剂量，以2 mL生理盐水溶解后经口腔灌胃。其余组喂服等量生理盐水，每天1次。

1.3.4 取材和测试

实验动物按照运动方案完成全部训练后，于第8周始按照SACIT组、IT组、TC组、C组的顺序依次取材：大鼠用乙醚麻醉，离断颈椎处死，开颅取出完整大脑，分离大脑海马区域。以预冷的生理盐水冲洗残余血液，滤纸吸干。以天平精密称量海马重量后研磨，组织匀浆用80%乙醇提取30 min后过滤，滤液以75℃水浴蒸干，再用pH=2.2柠檬酸缓冲液和10%偏磷酸按1∶1的比例溶解。离心取上清，在氨基酸自动分析仪上进行测试。

测定条件：1）层析柱：2.8 mm×300 mm；2）树脂床高度：185 mm；3）分析时间：65 min；4）缓冲液流速：10 mL/h；5）茚三酮流速：5 mL/h；6）缓冲液压力：4 826～5 515 kPa；7）缓冲液pH值：pH 3.28、pH 3.90、pH 5.20；8）层析柱温度：53℃；9）反应水浴温度：100℃；10）进样量：50µL；11）再生液：0.2 mol/L NaOH。

2 实验结果

由表1可知，谷氨酸（Glu）：与C组相比，其他3组极显著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.67、0.81、0.77），与TC组相比，IT组显著升高（P＜0.05，Cohen’s d=0.53）；天冬氨酸（Asp）：与C组相比，其他3组极显著降低（P＜0.01，Cohen’s d=0.82、0.91、0.90），与TC组相比，IT组和SACIT组极显著降低（P＜0.01，Cohen’s d=0.76、0.71）；γ-氨基丁酸（GABA）：IT组比C组、TC组和SACIT组极显著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.88、0.39、0.78），TC组比C组和SACIT组极显著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.87、0.69），SACIT组比C组极显著升高（P＜0.01,Cohen’s d=0.88）；甘氨酸（Gly）：C组和IT组比SACIT组极显著降低（P＜0.01，Cohen’s d= 0.90、0.61），TC组和SACIT组比C组极显著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.89、0.57），SACIT组比TC组显著降低（P＜0.05，Cohen’s d=0.42）；脯氨酸（Pro）：IT组比C组显著升高（P＜0.05，Cohen’s d=0.45），比TC组极显著升高（P＜0.01，Cohen’s d=0.60）；Glu/GABA比值：TC组和IT组比C组显著降低（P＜0.05，Cohen’s d=0.56）和极显著降低（P＜0.01，Cohen’s d=0.58），SACIT组比TC组和IT组显著升高（P＜0.05，Cohen’s d=0.43、0.47）。

表1 各组大鼠海马氨基酸类神经递质的变化（±SD，mg/100g）Table 1 Changes of Amino Acid Neurotransmitters in the Rat Hippocampus of Each Group

注：经单因素方差分析和S-N-K检验，与C组相比，♤表示P＜0.05，♠表示P＜0.01；与TC组相比，♧表示P＜0.05，♣表示P＜0.01；与IT组相比，♡表示P＜0.05，♥表示P＜0.01；与SACIT组相比，♢表示P＜0.05，♦表示P＜0.01。EAA表示兴奋性氨基酸；IAA表示抑制性氨基酸。

SACIT组61.92±2.54♠31.53±2.01♠♣24.05±0.76♣♠7.35±1.31♥♠9.08±1.17 2.61±0.67♧♡谷氨酸（EAA）天冬氨酸（EAA）γ-氨基丁酸(IAA)甘氨酸（IAA）脯氨酸（IAA）Glu/GABA比值C组52.56±4.85 43.16±3.53 19.41±1.72 5.76±0.63 8.45±1.56 2.75±0.58 TC组59.79±2.88♠35.33±1.73♠29.08±3.67♥♠8.33±0.70♠♢7.75±1.20 2.10±0.36♤IT组63.07±2.32♠♧30.52±2.33♠♣32.71±4.83♠♦8.91±0.88♠10.28±2.08♣♤1.96±0.54♠

按照Cohen的标准［14,18］，d值越大t检验的结果越可靠。通常把d值小于0.2时认为具有很小的效应量，即t检验结果可靠性较低；而d值在0.5附近具有中等效应量；d值大于0.8时具有大的效应量，即t检验结果具有比较大的可靠性。

3 讨论

众多研究显示，氨基酸类神经递质参与介导了运动疲劳导致的海马兴奋性变化。本实验结果显示，运动训练使大鼠海马回氨基酸类神经递质代谢增强，Glu/GABA比值降低，且运动强度越大，降低的越明显。对实验数据的分析表明，沙苑子可以显著对抗由运动诱导的大鼠海马Glu/ GABA比值下降和由此导致的中枢兴奋性减弱。

运动导致大鼠海马Glu/GABA比值降低，使大鼠海马神经元突触后抑制增强，兴奋性下降，可发展为中枢疲劳。而Glu脱羧生成GABA，GABA可最终氧化成琥珀酸（图1）。作为最主要的抑制性神经递质，运动中GABA在大脑中堆积的主要原因是由于谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）活性增高，而γ-氨基丁酸转氨酶（GABA transaminase，GABA-T）与琥珀酸半醛脱氢酶（succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH）活性下降，导致GABA在中枢堆积（图1）。聂玉芝［8］研究认为，GABA氧化减弱是导致GABA在脑中堆积的主要原因，并发现沙苑子下调GAD基因表达的同时上调了GABA-T和SSADH的基因表达，在减少GABA生成的同时加速了其氧化，从而减少了GABA在脑中的堆积。

本研究中，与C组相比，另外3组大鼠海马Asp均显著降低。降低的幅度依次为：IT组＞SACIT组＞TC组，且IT组与SACIT组显著低于TC组。说明，运动可以导致大鼠海马Asp含量下降，且运动强度越大，下降越明显。而沙苑子干预后，SACIT组大鼠海马Asp含量高于IT组，但无统计学差异。由于Asp难以通过血脑屏障，所以一般都是通过转化成天冬酰胺的形式出入大脑。作为一种兴奋性氨基酸递质，大鼠海马Asp含量随着运动中枢疲劳的发展而逐步减少，说明海马回作为支配运动技能形成的中枢结构和记忆环路，其兴奋性开始下降。而运动技能正是以记忆为基础形成的。海马记忆环路是以海马回作为起始和终了的神经冲动传导路线：海马→穹窿→下丘脑乳头体→丘脑前核→扣带回→海马，其中任何一个环节受到阻断都会导致短期记忆受损，出现动作技能不协调、变形、动作吃力、能耗增加等外周疲劳现象。本研究结果显示，沙苑子干预后大鼠海马Asp下降的趋势有所遏制。提示，沙苑子可能对运动大鼠海马Asp代谢存在一定正性影响。

图1 中枢氨基酸递质代谢关系示意图Figure 1.The Metabolic Pathway of Amino Acid Neurotransmitter in the Brain

Gly属于抑制性氨基酸。本研究结果显示，Gly在各组大鼠海马含量依次为：IT组＞TC组＞SACIT组＞C组，表明，Gly在大鼠海马中的水平随着运动强度的提升而增加。经沙苑子干预后，SACIT组大鼠Gly水平极显著低于未经药物干预的IT组，也显著低于未经药物干预的低强度运动组TC组。由于Gly不能通过血脑屏障，所以，海马中的Gly都由局部神经元合成和代谢，受循环中氨基酸的影响极小。提示，沙苑子能够显著抑制运动中大鼠海马Gly水平的上升，延缓其抑制过程和运动性中枢疲劳的发展。

各组大鼠Pro水平在各组变化情况为：IT组＞SACIT组＞C组＞TC组，但只有IT组相对于C组和TC组出现了显著性升高。有关Pro作为神经递质的资料较少，但有证据认为，Pro也属于一种抑制性中枢神经递质，脑室注射Pro可导致小鼠学习能力下降和逆行性记忆丧失［13］。海马神经元突触中存在大量NMDA（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受体，是LTP（long-term potentiation，LTP）产生的主要因素。Pro可以通过阻断Glu释放拮抗其产生的LTP效应［17］。本研究发现，与C组相比，低强度运动大鼠海马Pro水平略呈下降趋势，但无显著性差别，而大强度运动则导致大鼠海马Pro显著升高，经沙苑子干预后出现了降低趋势，但同样无显著性差异。Pro由Glu生成，所以，Glu不仅是GABA的前体，也是Pro的前体。根据运动性疲劳的“自我保护”学说，具有兴奋性的Glu在运动中代谢为抑制性的GABA和Pro，加强了中枢抑制并发展为运动性中枢疲劳，避免机体在运动中产生过度“损耗”，是一种负反馈调节，可以看做是机体在运动中产生的一种自我保护。

本研究的前期工作也发现［7,15,16］，力竭训练使大鼠血清天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）和尿素氮（blood usea nitrogen，BUN）显著升高，严重损害其肝肾功能。沙苑子对运动训练大鼠海马氨基酸类神经递质的调控作用可能与它补益肝肾的功能有关。中医认为，肾主骨、藏精、生髓，是“侧力”产生的重要源泉，肝主疏泄，若疏泄失调则可导致身体机能下降，促使疲劳出现［12］。黄崇刚等［2］用沙苑子干预醋酸棉酚和环磷酰胺所致的大鼠生精障碍模型后发现，沙苑子提取物能明显增加大鼠的精子数和精子活动率降低畸形率并提高其精囊腺指数，显著提高肾阳虚模型小鼠的体温及其自发活动次数，延长小鼠在低温环境中游泳的存活时间并增加其睾丸指数。这与沙苑子“补肾”“固精”的作用相符。孙利兵等［9］的研究证实，沙苑子黄酮对四氯化碳所致的小鼠肝损伤有明显的保护和抗脂质过氧化作用，说明沙苑子有护肝作用。王文心［11］的研究认为，沙苑子可以明显改善抑郁症小鼠的抑郁状态，有明显的抗抑郁作用。而抑郁症与大脑突触间隙的神经递质代谢失调密切相关。

4 结论

1.沙苑子能显著提高运动大鼠海马Glu和Asp含量而降低GABA、Gly和Pro水平，提高Glu/GABA比值，使大鼠海马整体兴奋性上升，有效对抗大强度运动产生的中枢抑制和中枢疲劳。

2.沙苑子还作用于海马回相关基因，降低GAD活性的同时升高GABA-T和SSADH酶活性，进而改变Glu/GABA比值的平衡状态，提升运动大鼠海马的兴奋性。

［1］范学辉，张清安，田呈瑞.沙苑子的生理功能评价研究进展［J］.安徽农业科学，2015，43（36）：4-6.

［2］黄崇刚，李恒华，梅小利，等.沙苑子补肾固精的作用研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：123-126.

［3］李洪娟.沙苑子的化学成分研究［J］.时珍国医国药，2011，22（3）：545-546.

［4］赖名耀，李娟，洪伟平.放射治疗损伤海马组织导致认知功能障碍的研究进展［J］.临床神经病学杂志，2016，29（1）：69-70.

［5］刘晓莉，陈艳芬，朱成才，等.运动疲劳大鼠可能通过海马LTP抑制及CaN蛋白表达增多降低学习记忆功能［J］.天津体育学院学报，2013，28（1）：8-11.

［6］刘占东，吴岩珏，王得新，等.慢性运动性中枢疲劳大鼠海马5-羟色胺及血清氨基酸的相关研究［J］.中国临床神经科学，2015，23（3）：274-279.

［7］刘志刚，唐文坤，徐广艳，等.大豆皂甙对运动力竭大鼠肝脏自由基代谢的影响［J］.云南师范大学学报，2015，35（2）：67-72.

［8］聂玉芝.沙苑子对运动训练大鼠脑组织中氨基酸类神经递质及相关基因表达影响的研究［D］.西安：陕西师范大学，2005.

［9］孙利兵，王尉平，顾振纶，等.沙苑子黄酮及表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠慢性肝损伤的保护作用［J］.解剖学杂志，2009，32（3）：408-410.

［10］吴培云，吴鸿飞，方方，等.沙苑子化学成分研究［J］.安徽中医药大学学报，2014，3（3）：91-94.

［11］王文心.补阳药沙苑子对小鼠抑郁模型的研究［J］.中医临床研究，2016，8（3）：20-21.

［12］杨瑾.沙苑子的生物学效应及其作为运动补剂的应用前景［J］.现代中药研究与实践，2015，29（1）：84-86.

［13］张丹参，张力，张士善.脯氨酸与学习记忆的关系［J］.中国药理学通报，1990，6（5）：280-281.

［14］COHEN J.The earth is round（P＜0.05）［J］.Am Psychol，1994，49（2）：997-1003.

［15］LIU Z G，LIU Y，XIONG Z Y，et al.Total soy saponins improve the antioxidant capacity of the myocardium and exercise ability in exhausted rats［J］.J Sport Health Sci，2015，4（4）：1-6.

［16］LIU Z G，NIE R X，LIU Y，et al.The effects of total soy saponins on free radicals in the quadriceps femoris，serum testosterone，LDH，and BUN of exhausted rats［J］.J Sport Health Sci，2016，5（1）：1-6.

［17］VAN H A，FIFKOVA E.Effects of amino acids on the isolated chicken retina，and on its response to glutamate stimulation［J］. J Neurochemi，1973，20（4）：947-962.

［18］ZHU W M.Sadly，the earth is still round（P＜0.05）［J］.J Sport Health Sci，2012，1（1）：9-11.

Study on the Regulatory Effects of Semen Astragali Complanati on the Amino Acid Neurotransmitters in the Gyri Hippocampi of Exercise Rats

LIU Zhi-gang1，NIE Yu-zhi2，LIU Qin1

Objective：To study the regulatory effects of semen astragali complanati（SAC）on the amino acid neurotransmitters in the gyri hippocampi of exercised rats.Methods：SD rats randomly divided into 4 groups：a control group（C group）；training control group（TC group）；intensive training group（IT group）；SAC intervention and intensive training group（SACIT group）.The rat’s hippocampal tissue was isolated after 7 weeks training.The tissue homogenate was prepared and extracted with 80%ethanol.The centrifugal supernatant was used to test by automatic amino acid analyzer.All data of each group are test by S-N-K of one way ANOVA.Results：Glu：compared with C group，Glu increase significantly in other three groups（P＜0.01），compared with TC group，Glu increase significantly in IT group（P＜0.05）.Asp：compared with C group，Asp significantly decrease in other three groups（P＜0.01），compared with TC group，Asp significantly decrease both in IT group and SACIT group（P＜0.01）.GABA：IT group are significantly higher than the other three groups（P＜0.01），TC group are significantly higher than C group and SACIT group（P＜0.01），SACIT group are significantly higher than C group（P＜0.01）.Gly：The C group and SACIT group are significantly lower than IT group（P＜0.01），TC group and SACIT group are significantly higher than C group（P＜0.01），SACIT group are significantly lower than TC group（P＜0.05）.Pro：IT group are significantly higher than C group（P＜0.05）and TC group（P＜0.01）. Glu/GABA：TC group and IT group are significantly lower than C group（P＜0.05），SACIT group are higher than both TC group and IT group（P＜0.05，P＜0.05）.Conclusions：SAC can significantly increase Glu，Asp and Glu/GABA ratio while decrease GABA，Gly and Pro in the gyri hippocampi of exercised rats.SAC can improve the excitability of the gyri hippocampi and show an effect against the exercise-induced central fatigue.

semen astragali complanati；gyri hippocampi；amino acid；neurotransmitter

1002-9826（2017）02-0134-05

10.16470/j.csst.201702018

G804.7

：A

2016-05-04；

：2016-09-23

国家自然科学基金资助项目（地区科学基金项目51568066）。

刘志刚，男，讲师，硕士，主要研究方向为运动生化与营养，E-mail：xbaili@126.com。

1.玉溪师范学院，云南 玉溪653100；2.北京市第 66中学，北京100053

1.Yuxi Normal University，Yuxi 653100，China；2.Beijing No.66 Middle School，Beijing 100053，China.